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Hilfestellung zur Ableitung variantenspezifischer PCR-Testungen aus charakteristischen Aminosäure-Austauschen und Deletionen bei SARS-CoV-2

Hintergrund

Variantenspezifische PCR-Testungen werden verwendet, um bereits definierte Virusvarianten (bspw. Delta) frühzeitig zu erkennen und zu erfassen. Dabei werden spezifische Mutationen mittels PCR erfasst, welche für Aminosäure-Austausche (bspw. P681R) oder/und Deletionen (bspw. Del157), meist innerhalb des Spikeproteins des Virus, verantwortlich und für relevante Viruslinien charakteristisch sind.

Fragestellung

Eine zentrale Frage besteht darin, welche Aminosäure-Austausche, Deletionen und auch Kombinationen charakteristisch für eine bestimmte Virusvariante sind und sich deshalb für den Nachweis einer Viruslinie eignen. Diese Informationen werden aktuell aus der Fachliteratur und öffentlichen Datenbanken (bspw. www.outbreak.info) abgeleitet, spiegeln dann jedoch nicht zwangsläufig die aktuelle Lage in Deutschland hinsichtlich zirkulierender Virusvarianten und deren Verteilung wieder.

Datengrundlage

Seit Anfang des Jahres 2021 werden SARS-CoV-2-Vollgenom-Sequenzen aus Deutschland über den Deutschen Elektronischen Sequenzdaten-Hub (DESH) an das RKI übermittelt. Diese Sequenz-Daten werden am RKI gesammelt, geprüft, analysiert und in öffentlichen Repositorien (bspw. Zenodo) dem wissenschaftlichen Fachpublikum zur Verfügung gestellt. Zusätzlich erfolgt am RKI täglich eine Annotation der Virusvarianten und Berechnung von Mutationsprofilen. Diese Daten liegen bspw. dem wöchentlichen „Variant of Concern“ VOC-Bericht zu Grunde, können aber auch verwendet werden, um charakteristische Aminosäure-Austausche und Deletionen und deren Verteilung in Bezug auf aktuell zirkulierende Virusvarianten in Deutschland zu bestimmen.

Berechnung und Interpretation

Grundsätzlich kann das Vorkommen von Mutationen sowie deren Häufigkeit unter den in Deutschland zirkulierenden Viruslinien für einen definierten Beobachtungszeitraum (bspw. 6 Wochen) ermittelt werden, um darauf basierend charakteristische Mutationen oder Mutationsmuster für VOC und VOI abzuleiten. Diese Berechnungen erfolgen, indem für eine bereits definierte Virusvariante (bspw. Delta) die Anzahl der beobachtbaren Mutationen oder Mutationsmuster, die zu Aminosäure-Austauschen oder Deletionen führen, durch die Gesamtanzahl aller Sequenzen dieser Virusvariante, jeweils bezogen auf den Beobachtungszeitrum, geteilt werden. Daraus ergibt sich ein prozentualer Anteil für jede Mutation oder jedes Mutationsmuster für relevante VOC und VOI. Die Ergebnisse werden in Tabellenform aufgetragen und können dabei helfen, die Linienspezifität von Mutationen und Mutationsmustern und folglich die Eignung dieser Mutationen für den PCR-basierten Nachweis einer Virusvariante besser einschätzen zu können. Die Tabelle wird in regelmäßigen Abständen und basierend auf dem aktuellen Infektionsgeschehen aktualisiert.

Hinweise zur Ergebnis-Verwendung

Die berechneten Häufigkeiten sind immer in Bezug auf den definierten Beobachtungszeitraum und die in diesem Zeitfenster gesammelten Sequenz-Daten zu interpretieren. Entsprechend können mit Hilfe der Tabelle keine Aussagen über Virusvarianten getroffen werden, die im definierten Zeitraum in den Sequenz-Daten nicht gefunden werden können. Da sich durch die Definition von Unterlinien die Nomenklatur der Viruslinien kontinuierlich anpasst, gibt in der Tabelle die Zeile „Main lineage“ die Beziehung zwischen Unterlinien (wie bspw. AY.1) und der nächsten Vorgängerlinie, die als VOC definiert ist (wie bspw. B.1.617.2, Delta), an. Außerdem gilt zu beachten, dass bestimmte Virusvarianten seltener auftreten als andere. Dafür zeigt die Tabelle in der Zeile „Number of sequences detected“, wie häufig die jeweiligen Virusvarianten im Beobachtungszeitraum beobachtet werden konnten. Die Summe aller weiteren im Beobachtungszeitrum detektierten Virusvarianten, die nicht als VOC oder VOI definiert sind, werden in der Tabellenspalte „Others pooled“ angegeben. Der Beobachtungszeitraum definiert den Entnahmezeitraum aller berücksichtigten Proben, für die Sequenzdaten via DESH an das RKI übermittelt wurden. Es sei darauf hingewiesen, dass die Qualität der berücksichtigten Sequenz-Daten sowie algorithmische Eigenheiten bei der Genomrekonstruktion (z.B. bei der Detektion und Lokalisation von Deletionen innerhalb der Genome) Einfluss auf die abgeleiteten Mutationsprofile und damit den gezeigten Häufigkeiten haben. Die zugrunde liegenden bioinformatischen Programme werden stetig weiterentwickelt, optimiert und an sich ändernde Parameter der verwendeten Sequenziertechnologien und Laborprotokolle angepasst. Auch der Prozess der sequenzbasierten Viruslinien-Bestimmung basierend auf dem Pangolin-Schema ist dynamisch und unterliegt kontinuierlicher Weiterentwicklung.

Anwendungsbeispiel

Im Beobachtungszeitrum vom 12. Juli 2021 bis einschließlich 26. August 2021 wurden insgesamt 22,004 SARS-CoV-2 Vollgenom-Sequenzen an DESH übermittelt und nach Qualitätsprüfung für weitere Analysen verwendet. Diese umfassen, nach Viruslinien-Zuordnung, 9,259 Delta Sequenzen (B.1.617.2, ohne Sublinien) und 295 Alpha Sequenzen (B.1.1.7, ohne Sublinien). Der exemplarische Tabellenausschnitt in Abb.1 zeigt, dass in 99% der Delta-Virusvarianten der Aminosäure-Austausch P681R erkannt werden kann, jedoch in keiner der im Beobachtungszeitraum betrachteten Alpha-, Beta- und Gamma-Virusvarianten. Hierbei ist jedoch zu beachten, dass die Daten für Beta (B.1.351) auf nur zwei Sequenzen beruhen die im definierten Zeitraum detektiert werden konnten. Für die VOI Epsilon (B.1.427) kann keine Aussage getroffen werden, da im definierten Zeitraum keine Sequenz-Daten B.1.427 zugeordnet werden konnten. Der exemplarische Tabellenausschnitt verdeutlicht weiterhin, dass P681R in keiner anderen VOC oder VOI im Beobachtungszeitraum gefunden werden kann, jedoch aber in 7% der 110 Sequenzen, die aktuell keiner VOC oder VOI zuzuordnen sind.

Exemplarischer Tabellenausschnitt für eine Auswahl von VOC und VOI Abbildung 1. Exemplarischer Tabellenausschnitt für eine Auswahl von VOC und VOI mit der Gesamtanzahl an detektierter Virusvarianten im Beobachtungszeitrum vom 12. Juli 2021 bis einschließlich 26. August 2021 sowie den prozentualen Anteilen des Aminosäure-Austausches P681R an den gezeigten Virusvarianten.

Stand: 02.09.2021

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