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Hilfestellung zur Ableitung variantenspezifischer PCR-Testungen aus charakteristischen Aminosäure-Austauschen und Deletionen bei SARS-CoV-2

Hintergrund

Variantenspezifische PCR-Testungen können verwendet werden um bereits definierte Virusvarianten (bspw. Omikron XBB.1.16) frühzeitig zu erkennen und zu erfassen. Dabei werden spezifische Mutationen mittels PCR erfasst, welche für Aminosäure-Austausche (bspw. S:T478R) oder/und Deletionen (bspw. S:Del25/27), meist innerhalb des Spikeproteins (S) des Virus, verantwortlich und für relevante Viruslinien charakteristisch sind.

Fragestellung

Eine zentrale Frage besteht darin, welche Aminosäure-Austausche, Deletionen und auch Kombinationen charakteristisch für eine bestimmte Virusvariante sind und sich deshalb für den Nachweis einer Viruslinie eignen. Diese Informationen werden häufig aus der Fachliteratur und öffentlichen Datenbanken (bspw. www.outbreak.info) abgeleitet, spiegeln dann jedoch nicht zwangsläufig die aktuelle Lage in Deutschland hinsichtlich zirkulierender Virusvarianten und deren Verteilung wieder.

Datengrundlage

Die seit Anfang des Jahres 2021 geltende Corona-Surveillanceverordnung (CorSurV) lief zum Juli 2023 aus. Im Rahmen der etablierten integrierten genomischen Surveillance (IGS) von SARS-CoV-2 werden am RKI jedoch weiterhin Genomsequenzierungen von SARS-CoV-2-positiven Proben durchgeführt. Die Proben stammen aus dem IMSSC2-Labornetzwerk, einem Projekt von RKI und Diagnostiklaboren aus ganz Deutschland. Darüber hinaus stehen in Abhängigkeit vom Infektionsgeschehen weitere SARS-CoV-2-Genomsequenzen zur Verfügung, die aus der erregerübergreifenden virologischen Sentinelsurveillance akuter Atemwegsinfektionen des RKI, sowie aus Untersuchungen des Nationalen Referenzzentrums für Coronaviren an der Charité stammen. Die am RKI rekonstruierten Genom-Consensus-Sequenzen sowie deren Viruslinien-Annotation stehen auf GitHub öffentlich zur Verfügung und bilden unter anderem die Grundlage des SARS-CoV-2 Virusvarianten Dashboards.

Neben einer täglichen Annotation der Viruslinien auf Basis der Genomsequenzen erfolgt am RKI auch eine Berechnung von Mutationsprofilen mit Hilfe des Tools covSonar. Diese Daten können verwendet werden, um charakteristische Aminosäure-Austausche und Deletionen und deren Verteilung in Bezug auf aktuell zirkulierende Virusvarianten in Deutschland zu bestimmen.

Berechnung und Interpretation

Grundsätzlich kann das Vorkommen von Mutationen sowie deren Häufigkeit unter den in Deutschland zirkulierenden Viruslinien für einen definierten Beobachtungszeitraum (bspw. 3 Monate) ermittelt werden, um darauf basierend charakteristische Mutationen oder Mutationsmuster für VOC, VOI und VUM abzuleiten. Diese Berechnungen erfolgen, indem für eine bereits definierte Virusvariante (bspw. Omikron XBB.1.16) die Anzahl der beobachtbaren Mutationen oder Mutationsmuster, die bspw. zu Aminosäure-Austauschen oder Deletionen führen, durch die Gesamtanzahl aller Sequenzen dieser Virusvariante, jeweils bezogen auf den Beobachtungszeitrum, geteilt werden. Daraus ergibt sich ein prozentualer Anteil für jede Mutation oder jedes Mutationsmuster für eine bestimmte Viruslinie. Die Berechnungen werden mit auf GitHub verfügbaren Python Skripten sowohl auf Nukleotid- als auch Aminosäure-Ebene durchgeführt. Per Default werden nur Mutationsprofile für Viruslinien berechnet, für die mindestens 10 oder mehr Genomsequenzen verfügbar sind. Alle weiteren Genomsequenzen werden unter „Other Lineages“ zusammengefasst und Mutationsfrequenzen über alle enthaltenen Genomsequenzen berechnet. Außerdem werden nur solche Nukleotid- und Aminosäure-Austausche in den finalen Tabellen aufgetragen, die in mindestens einer Viruslinie im Beobachtungszeitraum eine Mutationsfrequenz von mindestens 75% zeigen. Die Ergebnisse, aufgetragen in Tabellenform, können dabei helfen, die Linienspezifität von Mutationen und Mutationsmustern und folglich die Eignung dieser Mutationen für den PCR-basierten Nachweis einer Virusvariante oder im Rahmen von Abwasseranalysen besser einzuschätzen. Die Tabellen werden in regelmäßigen Abständen und basierend auf dem aktuellen Infektionsgeschehen aktualisiert.

Hinweise zur Ergebnis-Verwendung

Die berechneten Häufigkeiten sind immer in Bezug auf den definierten Beobachtungszeitraum und die in diesem Zeitfenster gesammelten Sequenz-Daten zu interpretieren. Entsprechend können mit Hilfe der Tabellen keine Aussagen über Virusvarianten getroffen werden, die im definierten Zeitraum in den Sequenz-Daten nicht gefunden werden können. Außerdem sind mit Auslaufen der CorSurV zum Juli 2023 weniger Proben und damit auch Sequenzdaten vorhanden, was sich auch auf die Berechnung der Mutationsfrequenzen auswirkt. Das RKI Virusvarianten Dashboard gibt eine Übersicht zu verfügbaren Genomsequenzen aufgetragen nach Kalenderwochen. Dabei ist zu beachten, dass sich die Zahlen durch Nachmeldungen und technisch bedingte Verzögerungen in der Prozessierung von Proben nachträglich erhöhen können. Außerdem gilt zu beachten, dass bestimmte Virusvarianten seltener auftreten als andere. Dafür zeigen die Tabellen in der Zeile „Number of sequences detected“, wie häufig die jeweiligen Virusvarianten im Beobachtungszeitraum sequenziert werden konnten. Der Beobachtungszeitraum definiert den Entnahmezeitraum aller berücksichtigten Proben. In einer weiteren Zeile der Tabellen wird angegeben, aus wie vielen unterschiedlichen Laboren Proben an das RKI übermittelt wurden („Labcounts“). Es sei darauf hingewiesen, dass die Qualität der berücksichtigten Sequenz-Daten sowie algorithmische Eigenheiten bei der Genomrekonstruktion (z.B. bei der Detektion und Lokalisation von Deletionen innerhalb der Genome) Einfluss auf die abgeleiteten Mutationsprofile und damit den gezeigten Häufigkeiten haben. Die zugrunde liegenden bioinformatischen Programme werden stetig weiterentwickelt, optimiert und an sich ändernde Parameter der verwendeten Sequenziertechnologien und Laborprotokolle angepasst. Auch der Prozess der sequenzbasierten Viruslinien-Bestimmung basierend auf dem Pangolin-Schema ist dynamisch und unterliegt kontinuierlicher Weiterentwicklung.

Unter anderem können niedrigere Frequenzen für eigentlich als charakteristisch beschriebene Aminosäure-Austausche auch auf Sequenzier- und Genomrekonstruktions-Fehler zurückzuführen sein (beispielsweise bekannter Amplikon-Ausfall der zu niedrigeren Frequenzen an den Spike Positionen K417N, N440K und G446S in frühen Omikron-Sequenzen führte). Weiterhin ist beim Primer-Design zu beachten, dass gerade in Omikron gehäuft nah beieinander liegende Aminosäure-Austausche vorkommen (z.B. S:N501Y und Umgebung), was zu zusätzlichen Bindungs- und damit Detektionsschwierigkeiten führen kann. Aufgrund der zunehmend hohen Sequenzvariabilität des Spikegens kann man also nicht sicher davon ausgehen, dass bereits etablierte Assaysysteme (z.B. zum Nachweis der N501Y Substitution) einen zuverlässigen Nachweis von Mutationen in der Omikron-Variante ermöglichen. Eine Überprüfung der Primer- und Sondensequenzen wird daher angeraten. Mit mehr verfügbaren SARS-CoV-2-Sequenzen verbessert sich auch diese Übersicht.

Anwendungsbeispiel

Im Beobachtungszeitrum vom 12. Juni 2023 bis einschließlich 13. September 2023 sind insgesamt 503 SARS-CoV-2 Vollgenom-Sequenzen vorhanden (Datenstand 13. September 2023). Diese umfassen, nach Viruslinien-Zuordnung, 97 EG.5.1.3, 34 EG.5.1.1, 30 EG.10.1, 22 EG.5.1, 22 EG.5.1.4, 21 XBB.1.16, 19 EU1.1.3 und 12 XBB.1.5 Virusvarianten des Omikron-Komplexes. Alle weiteren Viruslinien sind mit weniger als 10 Genomsequenzen im Datenstand vertreten und werden daher unter „Other Lineages“ zusammengefasst (n=246). Der Tabellenausschnitt zeigt, dass fast alle Genomsequenzen der EG.5* Virusvarianten den Aminosäureaustausch S:F456L tragen, während dieser auch zu geringen Anteilen in Genomsequenzen der XBB.1.5 und XBB.1.16 Virusvarianten gefunden werden kann. Außerdem tragen 31.7% aller anderen Virusvarianten mit weniger als 10 Genomsequenzen pro Lineage diesen Aminosäureaustausch. Weiterhin zeigt der Tabellenausschnitt S:T478R in allen XBB.1.16 Genomsequenzen, während S:T478K in den anderen gezeigten Virusvarianten dominiert. Somit würde sich S:T478R beispielsweise gut für eine Detektion von XBB.1.16 eignen, wobei zu beachten ist das auch 23.2% aller anderen im Beobachtungszeitraum detektierten Virusvarianten mit weniger als 10 Genomsequenzen pro Lineage diesen Aminosäureaustausch tragen.

Exemplarischer Tabellenausschnitt für eine Auswahl von VOC und VOI Abbildung 1. Exemplarischer Tabellenausschnitt für SARS-CoV-2 Virusvarianten und deren Gesamtanzahl an Voll-Genomsequenzen im Beobachtungszeitrum vom 12. Juni 2023 bis einschließlich 13. September 2023 sowie den prozentualen Anteilen jeweiliger Aminosäure-Austausche der gezeigten Virusvarianten. Alle weiteren Virusvarianten mit weniger als 10 Genomsequenzen pro Lineage sind unter „Other Lineages“ zusammengefasst.

Stand: 18.10.2023

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