Dreifache Rezeptor­bindung von Botu­linum Neuro­toxinen ist Schlüssel zur hohen Toxizität

Die bakteriellen Botulinum Neurotoxine (BoNTs) gelten als die giftigsten bekannten Substanzen überhaupt. Bereits kleinste Mengen sind in der Lage, zielgenau die Übertragung von Nerven­impulsen auf die Muskulatur zu unterbinden. Hierdurch werden charakteristische Lähmungserscheinungen hervorgerufen, die beim Krankheits­bild Botulismus, einer natürlichen Vergiftung, zum Tod durch Atemlähmung führen können. Aufgrund ihrer hochspezifischen Wirkung werden BoNTs jedoch auch sehr erfolgreich für die Behandlung von mehr als 20 neurologischen und nicht-neuro­logischen Erkrankungen und in der ästhetischen Medizin eingesetzt.

Eine Schlüsselrolle in Hinblick auf ihre hohe Wirksamkeit spielt das zielgenaue und stabile Andocken der Botulinum Neuro­toxine an spezifische Rezeptor­moleküle in der Membran von Nerven­zellen (Neuronen). Bislang ging man davon aus, dass die gleichzeitige Bindung an zwei Rezeptoren - einem Neuronen-spezifischen Protein­molekül sowie einem komplexen Zuckermolekül (Gangliosid) - dafür sorgt, dass die für die Aufnahme in die Neuronen notwendige stabile Verankerung vermittelt wird [1].

Wissenschaftler haben nun jedoch erstmals gezeigt, dass zusätzlich noch eine dritte Bindung direkt an die Lipidmembran notwendig ist, um die hohe Toxizität der Botulinum Neuro­toxine zu vermitteln (Abbildung 1) [2]. In einer Kooperation zwischen Wissen­schaftlern des Robert Koch-Instituts in Berlin, der Medizinischen Hochschule Hannover und der Technischen Universität München gelang es, den kritischen Beitrag einer Lipid-bindenden Schlaufe des Toxins zur Rezeptor­bindung und zur Toxizität zu beweisen. Die Studie wurde im Fachmagazin PLOS Pathogens veröffentlicht (Stern, D., J. Weisemann, A. Le Blanc, L. von Berg, S. Mahrhold, J. Piesker, M. Laue, P.B. Luppa, M.B. Dorner, B.G. Dorner, and A. Rummel, A lipid-binding loop of botulinum neurotoxin serotypes B, DC and G is an essential feature to confer their exquisite potency. PLoS Pathog, 2018. 14(5): p. e1007048: http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1007048).

Die Bindung der Botulinum Neurotoxine an eine Lipidmembran stellten die Forscher in vitro durch sogenannte Lipid-Nanodiscs nach. Nanodiscs sind ca. 10 Nanometer kleine, durch umhüllende Proteine stabilisierte Modell­membranen [3, 4], mit deren Hilfe auch komplexe Rezeptorstrukturen dargestellt und funktionell untersucht werden können. In der vorliegenden Arbeit gelang es erstmals, die Protein- und Gangliosidrezeptoren für die Botulinum Neurotoxine der Serotypen B, DC und G in Lipid-Nanodiscs einzubauen und die Interaktion auf molekularer Ebene biophysikalisch zu messen. Die Arbeiten lieferten den direkten Beweis, dass für die Aufnahme des Toxins in die Zelle eine Lipid-bindende Schlaufe des Toxins notwendig ist, die in die Membran integriert wird und die die stabile Bindung überhaupt erst vermittelt.

In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass diese Stabilisierung vor allem bei Körpertemperatur so wichtig ist, dass die Entfernung der Schlaufe zu einer dramatischen Abnahme der Toxizität um mindestens 99% führt. Letztendlich liefert die aktuelle Publikation neue Ansatzpunkte für die Entwicklung von Inhibitoren zur Behandlung des Botulismus sowie von optimierten BoNT-basierten Therapeutika. Die gewonnenen Erkenntnisse zeigen auch eine interessante Strategie auf, komplexe Interaktionen zwischen Pathogenitätsfaktoren wie Toxinen und Zellen künstlich nachzustellen und stellen ein neuartiges Paradigma dar, wie Toxine vielfältige Interaktionen mit verschiedenen Klassen von Makromolekülen – Zuckern, Proteinen und Lipiden – nutzen, um ihren Wirkmechanismus zielgenau und mit hoher Wirksamkeit zu vermitteln.

_{Abbildung 1: Schematische Darstellung der Bindung von Botulinum Neurotoxin Serotyp B (BoNT/B) an Gangliosid- und Proteinrezeptoren in der Lipidmembran. A. Kristallstruktur von Botulinum Neurotoxin Serotyp B (PDB ID 1EPW [5]) im Komplex mit dem Gangliosid-Rezeptor GD1a (Kugelmodelldarstellung) und dem Proteinrezeptor Synaptotagmin II (grüne, alpha-helikale Struktur; PDB ID 4KBB [6]). Kritische Aminosäuren, die in einer Lipid-bindenden Schlaufe des Toxins liegen und die an dessen Bindung an die Lipidmembran zwischen dem Gangliosid- und dem Proteinrezeptor beteiligt sind, sind rot dargestellt. Zur Untersuchung des Beitrags der Lipidbindung zur Rezeptorinteraktion wurde unter anderem die Bindung an in Lipid-Nanodiscs integrierte Rezeptormoleküle untersucht (Darstellung der Nanodiscs mit integrierten Phospholipiden und begrenzendem Membrane Scaffold Protein (blaue alpha-helikale Struktur) aus PDB ID 4V6M [7]). B. Modell, wie die Integration der Lipid-bindenden Schlaufe in die Lipidmembran zur Stabilisierung der Rezeptorbindung beiträgt. Durch Integration der Schlaufe in die Membran kommt es zu einer Zunahme an Bindungsentropie durch die Freisetzung von Wassermolekülen an der Interaktionsfläche, so dass der ungünstige Entropieverlust der dualen Rezeptorbindung durch Einschränkung der Beweglichkeit kompensiert wird.}

Das Fachgebiet Biologische Toxine im Robert Koch-Institut (ZBS3, www.rki.de/zbs3) ist eine nationale Referenzstelle für hochmolekulare biologische Toxine mit folgenden Arbeitsschwerpunkten:

• Diagnostik von Toxinen mikrobiellen und pflanzlichen Ursprungs, die für bioterroristische Anschläge genutzt werden können, mit zellbiologischen, genetischen und serologischen Techniken sowie mit chromatografischen Methoden und Massenspektroskopie,
• Konsiliarlabor für Neurotoxin-produzierende Clostridien (Botulismus, Tetanus) sowie DVG-Konsiliarlabor für C. botulinum / Botulinum Neurotoxinen in Lebensmitteln,
• Erstellung von SOPs für die Diagnostik,
• Bereitstellung von Referenzproben, Referenz­bakterien­stämmen und Standards, Vorhalten der Diagnostika,
• Anpassung der Diagnostika an die zu erwartenden Untersuchungs­materialien,
• Entwicklung von Strategien zum Nachweis neuer und veränderter Toxine und Agenzien,
• Forschung auf dem Gebiet der Pathogenese der verursachten Erkrankungen,
• Entwicklung von Strategien zur Prävention, Dekontamination und Bekämpfung
• Ringversuche zur Qualitätssicherung der Diagnostik,
• Mitwirkung an der Erstellung von Standardtherapien.

Literatur:

1. Rummel A: Two feet on the membrane: Uptake of Clostridial neurotoxins. Current Topics in Microbiology and Immunology, 2016: p. 1-37.
2. Stern D, Weisemann J, Le Blanc A, on Berg L, Mahrhold S, Piesker J, Laue M, Luppa PB, Dorner MB, Dorner BG, Rummel A: A lipid-binding loop of botulinum neurotoxin serotypes B, DC and G is an essential feature to confer their exquisite potency. PLoS Pathog, 2018. 14(5): p. e1007048.
3. Denisov IG, Sligar SG: Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol, 2016. 23(6): p. 481-6.
4. Denisov IG, Sligar SG: Nanodiscs in membrane biochemistry and biophysics. Chem Rev, 2017.
5. Swaminathan S, Eswaramoorthy S: Structural analysis of the catalytic and binding sites of Clostridium botulinum neurotoxin B. Nat Struct Biol, 2000. 7(8): p. 693-699.
6. Berntsson RP, Peng L, Dong M, Stenmark P: Structure of dual receptor binding to botulinum neurotoxin B. Nat Commun, 2013. 4: p. 2058.
7. Frauenfeld J, Gumbart J, Sluis EO, Funes S, Gartmann M, Beatrix B, Mielke T, Berninghausen O, Becker T, Schulten K, Beckmann R: Cryo-EM structure of the ribosome-SecYE complex in the membrane environment. Nat Struct Mol Biol, 2011. 18(5): p. 614-21.

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