Spezielle Licht- und Elektronenmikroskopie

Das primäre Anwendungsgebiet der nachfolgend dargestellten mikroskopischen Verfahren ist die Abbildung und Untersuchung von pathogenen Mikroorganismen (Bakterien, Viren, Pilze, Parasiten) und anderen Pathogenen (z.B. Prionen) im Zusammenhang mit der Erforschung oder Bekämpfung von Krankheiten des Menschen.

Konfokale Laserscanning-Mikroskopie (cLSM)

Fluoreszenzmikroskopie mit hoher räumlicher Auflösung und Sensitivität, inkl. 3D-Rekonstruktion und spektraler Detektion der Signale. Die inverse Konfiguration des Stativs und die Einhausung in eine Zellkulturkammer ermöglichen die Lebendzellmikroskopie (s.d.).

Bild1: Konfokale Laserscanning-Mikroskopie (cLSM) von Retroviruspartikeln (rot), die an der Oberfläche von Zellen gebildet werden.

TIRF-Lasermikroskopie

Die „Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)“ Lasermikroskopie ermöglicht an der Grenzfläche zum Probenträger eine sehr hohe z-Auflösung, da Fluorophore nur in einer schmalen Zone nahe dieser Grenzfläche angeregt werden. Diese Form der Mikroskopie eignet sich für Interaktionsstudien von adsorbierten Molekülen, oder fluoreszierenden Strukturen, die an Grenzflächen von Zellen erscheinen oder lokalisiert sind (z.B. Virus-Ausschleusung, Oberflächenrezeptoren).

Lebendzellmikroskopie

Die Lebendzellmikroskopie ermöglicht die mikroskopische Verfolgung von Zellen in Kultur und zellulärer Ereignisse über die Zeit. Hierfür stehen dem Institut drei Systeme zur Verfügung: die konfokale Laserscanning-Mikroskopie (cLSM), TIRF-Lasermikroskopie und die automatisierte Lebendzellmikroskopie mit Weitfeld-Fluoreszenz.

cLSM: Lebendzellmikroskopie von wenig zeitkritischen Vorgängen (ab etwa 1 Minute aufwärts) mit hoher z-Auflösung. Interaktionsanalysen mittels Resonanz-Transfer (FRET). Analyse der Dynamik von Vorgängen durch regionales Bleichen (FRAP).

TIRF: Schnelle Fluoreszenz-Mikroskopie mit hoher z-Auflösung (100 nm) von Fluoreszenz-Signalen an der Grenzfläche des Objektträgers bzw. von Zelloberflächen.

Standard-Lebendzellmikroskopie (Hellfeld, Phasenkontrast, DIC, Weitfeld-Fluoreszenz): Das motorisierte inverse Mikroskop ist mit einer Zellkulturkammer, zwei Kamerasystemen (Farbkamera, EMCCD) und einer Hochleistungs-Fluoreszenzlampe mit schnellem Wechsel der Anregungswellenlängen für die Aufzeichnung schneller fluoreszierender Ereignisse (z.B. Tracking von Objekten) ausgestattet. Das Mikroskop eignet sich besonders für die Langzeitbeobachtung (mehrere Tage) von Zellkulturen oder die Untersuchung von Bakterien mit differentiellem Interferenzkontrast oder Phasenkontrast. Die schonende Untersuchung der Ko-Expression verschiedener fluoreszierender Proteine in Zellkultur wird durch die schnell umschaltende Anregungswellenlänge und die hochsensitive Kamera ermöglicht.

Bild 2: Zeitrafferaufnahme von beweglichen Bakterien (Acinetobacter baumannii). Verfolgung („Tracking“) einzelner Bakterien über die Zeit (farbige Spuren).

Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM)

Die korrelative Mikroskopie erlaubt die Mikroskopie ein- und derselben Probenstelle mit verschiedenen Mikroskopen. Unser Standardverfahren ermöglicht die Untersuchung von Zellkulturen mittels hochauflösender Licht/Lasermikroskopie (inkl. Lebendzellmikroskopie) mit nachfolgender Elektronenmikroskopie, um Oberflächen oder interne Details der Zellen mit höherer Auflösung abzubilden.

Bild 3: Korrelative Mikroskopie von Mitose-Strukturen in Amöben. Links: Hellfeld/Fluoreszenzmikroskopie von Amöben, die sich in der Mitose (Vorbereitung der Zellteilung) befinden und deren DNA mit einem blau leuchtendem Farbstoff markiert wurde. Mitte und rechts: Transmissions-Elektronenmikroskopie eines Ultradünnschnittes durch die links gezeigten Zellen. Das blaue Fluoreszenzsignal wurde zur Orientierung im mittleren Bild überlagert und ist deckungsgleich mit kondensiertem Chromatin, das mit einem Mikrotubulus-Spindelapparat assoziiert ist.

Raster-Elektronenmikroskopie

Die Raster-Elektronenmikroskopie ermöglicht die tiefenscharfe, hochauflösende Abbildung von Oberflächen. Sie wird u.a. für die Untersuchung von Zellkulturen, Bakterienkolonien, Parasiten und von Gewebeaufbrüchen verwendet. Folgende Techniken sind am Institut verfügbar:

• In-lens Feld-Emissions-Rasterelektronenmikroskopie (Topographie- und Material-Kontrast)
• Mobile Desktop-Rasterelektronenmikroskopie mit Niedrig-Vakuum-Modus
• Kryo-Rasterelektronenmikroskopie mit Kryotransfer-System
• Beschichtung von Oberflächen mit Edelmetallen (auch im Kryo-Modus) und Kohle
• Automatisierte Kritisch-Punkt-Trocknung
• Ortsaufgelöste Elementanalyse mittels energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDX)
• Abbildung größerer Präparate-Volumina mit „Serial-Blockface-Imaging“

Bild 4: Raster-Elektronenmikroskopie (Topographie-Kontrast) von keimenden Sporen des Bakteriums Bacillus subtilis.

Transmissions-Elektronenmikroskopie

Die Transmissions- oder Durchstrahlungs-Elektronenmikroskopie wird zur hochauflösenden Ultrastruktur-Untersuchung dünner Objekte (Partikel oder Schnitte) verwendet. Eine Spezialmethode ist die diagnostische Elektronenmikroskopie von Infektionskrankheiten (www.rki.de/kl-em). Folgende Techniken sind am Institut verfügbar:

• Negativkontrastierungs-Technik (Proteine, Viren, Bakterien)
• Ultradünnschnitt-Technik (Standard-Verfahren, Tieftemperatur-Einbettung, Schnell-Einbettungsverfahren, Gefrierschnitt-Technik nach Tokuyasu)
• Immunzytochemie mittels Immunogold-Methode
• Kryomethoden (Hochdruck-Kryofixierung, Immersions-Kryofixierung, Gefriersubstitution)
• Elektronen-Tomographie

Bild 5: Transmissions-Elektronenmikroskopie eines ultradünnen Schnittes durch einen Biofilm des Bakteriums Acinetobacter baumannii (Hochdruck-Kryofixierung, Gefriersubstitution, Epon-Einbettung).

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