Fotoserie zur Diagnostik von Influenzaviren
Stand: 02.01.2024
Das Nationale Referenzzentrum (NRZ) für Influenzaviren im Robert Koch-Institut
Im Rahmen der bundesweiten Influenza-Überwachung (auch Surveillance genannt) untersucht das Team des NRZ eingesandte Patientenproben auf Influenzaviren und charakterisiert sie genauestens. Wie viele andere Labore weltweit trägt das NRZ damit auch zur globalen Influenza-Überwachung bei: Die virologischen Daten werden jede Woche an die Weltgesundheitsorganisation übermittelt. Das NRZ untersucht die Proben auch auf andere Viren, die akute Atemwegserkrankungen auslösen, zum Beispiel Rhino- oder Respiratorische Syncytial-Viren (RSV).
Elektronenmikroskopische Aufnahme von Influenza-A-Viren
Der Durchmesser eines Viruspartikels beträgt ein Zehntausendstel Millimeter. Die Hülle der Viren ist von den Oberflächenproteinen Hämagglutinin (H) und Neuraminidase (N) bedeckt, mit deren Hilfe das Virus in die Körperzellen eindringt, sich darin vermehrt und die neuen Viren wieder aus der Zelle freisetzt. Vom Hämagglutinin sind 18 Varianten bekannt (H1 bis H18), von der Neuraminidase 11 (N1 bis N11). Die verschiedenen Subtypen der Influenza-A-Viren werden nach den Oberflächenproteinen benannt: Die saisonale Influenza etwa wird seit Jahrzehnten durch die Subtypen A(H1N1) und A(H3N2) ausgelöst; die für Geflügel besonders gefährlichen hochpathogenen Influenza-Viren gehören zu den H5- oder H7-Subtypen. Neben Influenza-A-Viren gibt es auch Influenza-B-Viren, die in verschiedene Linien unterteilt werden (Victoria- und Yamagata-Linie) und ebenfalls während der Grippesaison auftreten.
Probeneingang
Während der Grippewelle kommen jeden Vormittag dutzende Schachteln mit Untersuchungsmaterial im NRZ für Influenza an – darin Nasen- oder Rachenabstriche von Patienten mit Grippesymptomen und ein Fragebogen mit Angaben zum Krankheitsverlauf. Eingeschickt wird das Material von rund 150 niedergelassenen Arztpraxen aus ganz Deutschland, die sich an der bundesweiten Influenza-Überwachung beteiligen. Diese sogenannten Sentinel-Praxen sind ein zentraler Teil der Arbeitsgemeinschaft Influenza (AGI) des Robert Koch-Instituts. Information für Praxen, die an einer Teilnahme interessiert sind, sind abrufbar unter https://influenza.rki.de/Sentinelpraxis.aspx.
Probenaufbereitung
Eine Mitarbeiterin bereitet die Tupfer mit der Patientenprobe vor: ein Teil dient als Ausgangsmaterial für die Polymerasekettenreaktion (PCR), ein anderer wird zur Virusanzucht verwendet. Ein weiterer wird als Rückstellprobe aufbewahrt.
Isolieren des Erbmaterials
Um das Erbgut untersuchen zu können – etwa um nachzuweisen, um welchen Influenza-Subtyp es sich genau handelt – muss das Erbmaterial der Influenzaviren zunächst isoliert werden. Dies geschieht nach entsprechender Vorbereitung der Proben automatisiert in einem Nukleinsäure-Extraktor (rechts im Bild).
Vorbereiten der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Mit dieser Methode kann die Reihenfolge der Erbgutbausteine (Gensequenz) schnell untersucht werden. Mit einer PCR lassen sich zum Beispiel die verschiedenen Influenza-Subtypen schnell nachweisen – ob es sich also um Influenza A(H3N2), A(H1N1) oder eine der beiden Influenza-B-Linien handelt. Als Ausgangsmaterial reicht eine sehr kleine Menge an Virus-Erbgut aus. Um das Material vor Verunreinigungen zu schützen, die das Ergebnis verfälschen könnten, pipettiert die Mitarbeiterin den Reaktionsansatz in einer speziellen Werkbank.
Auswertung der Polymerase-Kettenreaktion
Während der PCR wird eine kleine Gensequenz – Primer genannt – zu der Probe gegeben. Der Primer passt nur zu einem bestimmten Influenza-Subtyp. Findet er in der Probe die passende Gensequenz, bindet er dort. Die Gensequenz wird vervielfältigt (amplifiziert) und erscheint als Amplifikationskurve auf dem Bildschirm. So wird gezeigt, dass dieser bestimmte Influenza-Subtyp in der Probe vorliegt.
Virusanzucht in der Zellkultur
Influenzaviren lassen sich in Zellkulturen vermehren. Hierfür infizieren die Mitarbeiterinnen des NRZ Zellen in speziellen, mit einer Nährlösung gefüllten Röhrchen und lagern sie etwa eine Woche im Brutschrank. Während dieser Zeit vermehren sich die Viren und zerstören die Zellen. Die so gewonnenen Viren werden zur Antigen-Charakterisierung und zur umfangreichen Erbgutanalyse verwendet. Außerdem testen die Mitarbeiterinnen, ob die Viren resistent gegen Grippemedikamente sind.
Analyse der Zellen
Zellen, die mit Viren infiziert sind, nehmen eine charakteristische Form an. Zeigt sich unter dem Mikroskop eine deutliche Veränderung der Zellform (Morphologie), befanden sich im Patienten-material vermehrungsfähige Influenzaviren.
Virusanzucht im Hühnerei
Alternativ zur Zellkultur können Grippeviren auch in befruchteten Hühnereiern angezüchtet werden. Dafür wird mit einer Kanüle eine kleine Menge einer Flüssigkeit, die die Viren enthält, durch die Schale in das Ei gespritzt. Das Ei wird anschließend bei 37 Grad Celsius bebrütet. Nach ein bis zwei Tagen kann man die Eier öffnen und virushaltige Flüssigkeit mit einer Spritze entnehmen. Das NRZ für Influenza verwendet diese Methode jedoch nur in Ausnahmefällen, dann vor allem für die Vermehrung ausgewählter Impfstämme und zur Untersuchung von Antigenen.
Hämagglutinationshemmtest
Die Zusammensetzung der Grippeimpfstoffe muss jedes Jahr neu angepasst werden, weil sich Grippeviren schnell verändern und immer neue Varianten der verschiedenen Subtypen zirkulieren. Um zu überprüfen, welche Varianten genau im Umlauf sind – und ob die Impfung passt – werden die Antigene der Grippeviren mit dem Hämagglutinationshemmtest charakterisiert. Antigene sind Proteine auf der Oberfläche der Viren, gegen die das Immunsystem Antikörper bildet, zu ihnen gehört auch das Hämagglutinin. Beim Hämagglutinationshemmtest bringt man die angezüchteten Influenzaviren mit Immunseren zusammen. Wenn die auf der Virusoberfläche vorliegenden Varianten von Hämagglutinin zu den Antikörpern in den Seren passen, entstehen Antigen-Antikörper-Komplexe. Die Viren können dann rote Blutkörperchen nicht mehr binden,– deren Verklumpung (Hämagglutination) wird gehemmt. Die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) sinken ab und sind auf dem Boden der Probenplatte zu erkennen: kippt man diese, laufen sie strichförmig aus. Im Gegensatz dazu sind in nicht durch Antikörper gehemmten Proben die Erythrozyten als vernetzter rötlicher Bodenbelag in den Löchern der Platte zu erkennen, der nicht ausläuft.
Erbgutanalyse
Etwa 20 Prozent der im AGI-Sentinel nachgewiesenen Influenzaviren werden sequenziert: dabei wird die Reihenfolge der Erbgutbausteine untersucht, um die Verwandtschaft der isolierten Virusstämme beurteilen zu können. In sogenannten Sequenzierern wird die Abfolge der Erbgutbausteine automatisch ermittelt und auf dem Bildschirm dargestellt. Genetische Veränderungen der Influenzaviren und neue Influenza-Varianten können so sehr früh erkannt werden. Die Sequenzierung kann auch Hinweise auf Resistenzen gegen Influenza-Medikamente geben.
Influenza-Schnelltest
Schnelltests können ohne Laborausstattung innerhalb von zehn bis 20 Minuten an Rachen- oder Nasenabstrichen durchgeführt werden. Beim Test im Bild wird das positive Ergebnis durch rote Linien angezeigt – die blaue Kontrolllinie in der Mitte muss bei einem gültigen Test immer vorhanden sein. Schnelltests werden vor allem in Arztpraxen eingesetzt, etwa um zu entscheiden, ob ein Patient mit einer Vorerkrankung rasch ein Grippemedikament einnehmen sollte. Mit manchen Tests (wie der im Bild) lassen sich Influenza A- und B-Viren unterscheiden, verschiedene Subtypen oder Linien jedoch nicht. Wenn die Antigenkonzentration in der Probe unterhalb der Nachweisgrenze liegt, kann es auch zu einem falsch-negativen Ergebnis kommen. Die Testergebnisse müssen daher immer zusammen mit den klinischen Daten bewertet werden.
