Hinweise zur Labor­dia­gnos­tik bei V.a. Pest

• Hintergrund
• Benötigte Informationen
• Klinische Proben
• Literatur

Hintergrund

Pest ist eine schwere, schnell fort­schrei­tende und lebens­be­drohliche bakterielle Erkrankung, die durch das gram-negative Bakterium Yersinia pestis hervor­gerufen wird. Die Letalität ist hoch und kann bei nicht behandelten Patienten mit Lungen­pest bis zu 100% betragen. Deshalb ist eine schnelle Diagnose und damit Ein­leitung einer effektiven Therapie von entschei­dender Bedeutung. Der Verdacht einer Pest­er­krankung ist bei Patienten anzu­nehmen, die eine entsprechende klinische Sympto­matik und ggf. Reise­anam­nese in ende­mische Pestge­biete aufweisen (siehe RKI-Ratgeber zu Pest und Flussschema begründeter Verdacht).

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Benötigte Informationen

Folgende Informationen sind vom Einsender von Unter­suchungs­proben für das mikrobio­lo­gische Diagnostik­labor wichtig, um die Proben in rich­tiger Art und Weise zu bearbeiten:

1. Patientenname oder Identifi­zierungs­nummer
2. Typ des Unter­suchungs­materials (z.B. Sputum, Lymphknoten, Aspirate etc.)
3. vermutete Ansteckungs­quelle
4. Datum des Beginns der Symptome
5. Kurze Beschreibung der Symptome
6. Datum und Zeit der Abnahme des Unter­suchungs­materials
7. Informationen zur Antibiotika­therapie (Startzeit, eingesetzte Antibiotika und deren Dosis, auch unter Berück­sichtigung einer evtl. Malaria­prophylaxe (Tetra­cycline, z.B. Doxycyclin), wenn möglich
8. Angaben zur Reise­anamnese (Datum der Ankunft und Abreise in Endemiegebiete), wenn zutreffend

Eine Vorab­ankündigung der Probe und ggf. Absprachen zum Proben­versand mit dem Diagnostik­labor ist in der Regel notwendig.

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Klinische Proben

Hinweise zur Probennahme und zum Probenversand finden sich im RKI-Ratgeber zu Pest unter 2. Labor­diagnostik.

Allgemeine Anmer­kungen zu diagnostischen Methoden

Unbestätigte Primärproben müssen mindestens unter Schutzstufe 2 analysiert werden. Proben von bestätigten Patienten mit anhaltender klinischer Manifes­tation sowie Anreiche­rungen und Kulturen von Y. pestis müssen unter Schutzstufe 3 bearbeitet werden. Sicher inakti­viertes Material (validiertes Verfahren) kann unter Schutzstufe 2 bearbeitet werden.

Es ist anzu­merken, dass positive und negative Ergebnisse nach Möglichkeit mit verschiedenen Methoden abgesichert werden sollten, z.B. PCR mit verschiedenen Ziel­sequenz­abschnitten, zusätzlich Isolat­gewinnung, immuno­logische Verfahren.

Sollten die Unter­suchungs­ergeb­nisse in einem frühen Stadium der Erkrankung negativ ausfallen, ist bei anhal­tendem klinischem Verdacht auf eine Pest­er­krankung und Progression der klinischen Sympto­matik eine weitere labor­diagnos­tische Unter­suchung durchzu­führen.

Immuno­logische Schnell­verfahren sind in erster Linie auf die Detektion des F1-Kapsel­antigens ausgerichtet und werden in der Praxis insbesondere bei Pestaus­brüchen angewendet. Positive Ergebnisse können auf eine Pesterkrankung hinweisen; negative Ergebnisse sind wegen der relativ geringen Sensitivität der Assays nicht aussagekräftig. Zudem sind diese Tests meist nicht für die Diagnostik beim Menschen zugelassen. Die Ergebnisse sollten in jedem Fall mit anderen etablierten Methoden bestätigt werden. Um Kulturen des Erregers mit der Detektion des F1-Antigens zu identi­fizieren, müssen diese bei 37°C inkubiert werden, da das Antigen bei niedri­geren Temperaturen (wie 28°C s.u.) nicht produ­ziert wird.

Spezielle diagnostische Methoden

Ein direkter Erreger­nachweis kann durch klassische Mikroskopie von Blut­aus­strichen, Sputum- oder Sekretproben erfolgen. Y. pestis erscheint mit verschiedenen Färbe­verfahren als kurzes, gram-negatives Stäbchen mit einer charakteris­tischen bipolaren Färbung ("safety pin"). Die Wahr­schein­lich­keit eines mikrosko­pischen Erreger­nachweises ist in frühen Stadien der Erkrankung eher gering. In Aspiraten aus Bubonen kann der Erreger in der Regel gut mikroskopisch beobachtet werden. Empfohlene Färbungen und Nachweis­verfahren sind: Gram, Wright, Giemsa, Waysons’s, - Methylenblau. Immun­fluoreszenz mit Anti­körpern gegen das F1-Kapsel­antigen und Fluoreszenz-in situ-Hybri­disierung (FISH) sind nur in einigen Spezial­labo­ratorien verfügbar.

Zur Abklärung eines begründeten Verdachts­falls sollten sowohl eine PCR als auch ein kultureller Erregernachweis durchgeführt werden. PCR-Verfahren eignen sich insbesondere für die Akut­diagnostik und weisen in der Regel die Gene des F1-Kapsel­antigens (caf1) und des Plasmino­gen­aktivators (pla) nach.

Ein Isolat ist bei Vorhanden­sein entsprechender Sicherheits­bedingungen (Schutzstufe 3 zur weiteren Charakte­risierung) immer anzustreben. Ggf. sollten dafür Proben an entsprechend ausgerüstete Spezial­laboratorien gesendet werden. Das Bakterium benötigt in der Regel mindestens 24h, eher 48h, bis Kolonien sichtbar werden. Da die Bakterien schnell von Begleit­flora über­wachsen werden können, sollten Selektiv­nährboden, wie modifizierter CIN-Agar (4 mg/l Cefsulodin, kein Irgasan), eingesetzt werden. Das beste Wachstum der Bakterien wird bei 28°C erzielt (keine Produktion von F1-Kapsel­antigen!).

Die Anti­mikro­bielle Sensitivitäts­testung (AST) von Isolaten sollte nach Möglichkeit immer durch­geführt werden (Schutzstufe 3 erforderlich!). Für die Durchführung der Testung und Inter­pretation der Ergebnisse können die Empfehlungen des Clinical and Standards Institute (CLSI), M45-A2 heran­gezogen werden. Es sollten mindestens folgende Substanzen getestet werden: Genta­micin, Strepto­mycin, Cipro­floxacin, Levo­floxacin, Doxycyclin, Trimethoprim/Sulfamethoxazol und Chloram­phenicol. Eine Empfehlung vom EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) gibt es derzeit nicht.

Als weitere Methode ist ein Nachweis des F1-Kapsel­antigens möglich, in äußerst seltenen Fällen kann es F1-negative Stämme geben. Sein Nachweis gelingt mit verschiedenen immuno­logischen Verfahren (u.a. ELISA, Zyto­fluoro­metrie, Streifentest). Die Limi­tierungen von Schnelltests sind bereits weiter oben beschrieben worden.

Antikörper­nachweise eignen sich für retro­spektive und epidemio­logische Unter­suchungen. Als spezifisches Antigen wird in der Regel das F1-Kapsel­antigen eingesetzt. Derzeit stehen nur In-house-Tests in wenigen Spezial­laboratorien zur Verfügung.

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Literatur

• Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria, 3rd Edition, M45.
• Riehm JM, Rahalison L, Scholz HC, Thoma B, Pfeffer M, Razanakoto LM, Al Dahouk S, Neubauer H, Tomaso H. Detection of Yersinia pestis using real-time PCR in patients with suspected bubonic plague. Mol Cell Probes. 2011 Feb;25(1):8-12.
• Manual of Clinical Microbiology, 10th Edition. Editors: James Versalovic, Karen C. Carroll, Guido Funke, James H. Jorgensen, Marie L. Landry, David W. Warnock.
• Zoonoses. Infectious Diseases Transmissible from Animals to Humans. 3rd Edition. Editors: Hartmut Krauss, Albert Weber, Max Appel, Burkhard Enders, Henry D. Isenberg, Hans G. Schiefer, Werner Slenczka, Alexander von Graevenitz, Horst Zahner.

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