183. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaberin

Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH)

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HUES8 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• MEL-1 (University of Queensland, Melbourne, Australien)

Im Rahmen der Erweiterung der Genehmigung vom 06.02.2024 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen einer weiteren Linien genehmigt:

• HES-3 (ES Cell International Pte. Ltd., Singapore)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Vor dem Hintergrund, dass derzeit verfügbare Vorgehensweisen für die In-vitro-Gewinnung pankreatischer Inselzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen stets zu Zellen eines noch unreifen Phänotyps führen, sollen die genehmigten Forschungsarbeiten zum einen dazu beitragen, Regulatoren der Differenzierung, Reifung und authentischen Funktion humaner pankreatischer Inselzellen zu identifizieren bzw. detaillierter als bislang zu charakterisieren. Zum anderen soll ein tieferer Einblick in die Regulation des Stoffwechsels von aus pluripotenten Stammzellen abgeleiteten pankreatischen Zellen gewonnen werden, wobei zelluläre Faktoren identifiziert und charakterisiert werden sollen, die an der Regulation des Metabolismus (sich entwickelnder und reifer) pankreatischer Zellen beteiligt sind.

Unter Nutzung einer Reihe von genetisch modifizierten hES-Zell-Linien soll zunächst untersucht werden, welche Konsequenzen ein funktionaler Knockout der Gene für spezifische Transkriptionsfaktoren auf die Eigenschaften insbesondere von Beta-Zellen hat, wobei Veränderungen in der In-vitro-Differenzierung und -Reifung, im Metabolismus, im Transkriptom und im Proteom detailliert untersucht und die Fähigkeit der genetisch veränderten Zellen zur Korrektur einer Hypoinsulinämie nach Transplantation in Mausmodelle des Diabetes bewertet werden sollen. Ferner soll die Rolle des alternativen Splicing in pankreatischen Zellen – u. a. durch Ausschaltung bestimmter Splicing-Faktoren oder durch ektopische Expression mutierter Gene für diese Faktoren – für die Differenzierung, Reifung und Funktionalität von pankreatischen Zellen umfassend untersucht werden. Hierdurch sollen u. a. Wechselwirkungspartner und Ziel-RNAs der betreffenden Splicing-Faktoren in pankreatischen Zellen identifiziert und näher charakterisiert werden. Ferner soll die Rolle von MAF-Transkriptionsfaktoren, die für die Entwicklung und Funktion des Pankreas essentiell sind, in aus hES-Zellen abgeleiteten Inselzellen näher untersucht werden, wobei die Konsequenzen eines Knockout des MAFB-Gens (auch im Kontext der Überexpression des MAFA-Gens) sowie die Folgen der (Über)Expression von mutierten MAFA-Varianten auf Differenzierung, Reifung, Metabolismus und Funktionalität der jeweiligen pankreatischen Zellen analysiert werden sollen.

Da die Ursachen einer mit Typ-2-Diabetes (T2D) einhergehenden mitochondrialen Dysfunktion nur unzureichend erforscht sind, soll dann die Rolle spezifischer Enzyme für die Funktionalität von Beta-Zellen untersucht werden. Die entsprechenden Gene sollen in sich aus hES-Zellen entwickelnden Beta-Zellen zum einen funktional deletiert, zum andern ektopisch überexprimiert werden. Die jeweiligen Konsequenzen für die weitere Entwicklung zu Beta-Zellen, für die (metabolischen) Funktionen pankreatischer Zellen sowie für die jeweiligen Transkriptome und Proteome sollen dann im Detail bestimmt werden. Ferner sollen die Zellen in Nagermodelle transplantiert und ihre Eigenschaften auch in vivo untersucht werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) der Erreichung hochrangiger Forschungsziele in der Grundlagenforschung:

Zwar sind bei der Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in pankreatische Zellen erhebliche Fortschritte erzielt worden, jedoch ist das Verständnis von der pankreatischen Differenzierung beim Menschen weiterhin unvollständig, und die Protokolle für die In-vitro-Differenzierung pluripotenter Stammzellen zu Beta-Zellen bzw. pankreatischen Inseln sind weiterhin suboptimal. Insbesondere entsprechen der Reifegrad und die Funktionalität der bislang in vitro gewinnbaren pankreatischen Zellen nicht der In-vivo-Situation beim Menschen. Mit dem Forschungsvorhaben soll dazu beigetragen werden, bestimmte Prozesse der pankreatischen Differenzierung und die Rolle einzelner, für die Differenzierung und Reifung pankreatischer Zellen bedeutsamer Faktoren und Signalwege besser als bislang zu verstehen. Zudem sollen, ebenfalls über ein verbessertes Verständnis der molekularen Grundlagen, die Ursachen für metabolische Defizite und mitochondriale Dysfunktionen in pankreatischen Zellen aufgeklärt werden.

Zunächst soll die Funktion bestimmter Faktoren, die an der Entwicklung pankreatischer Zellen beteiligt sind, bei der Aufrechterhaltung der Integrität dieser Zellen, insbesondere für ein korrektes alternatives Splicing, untersucht werden. Dabei soll durch die (konditionelle) Inaktivierung der entsprechenden Gene zunächst ermittelt werden, welche physiologischen, metabolischen und molekularen Prozesse in aus hES-Zellen differenzierten Beta-Zellen hierdurch verändert werden, wodurch Rückschlüsse auf mögliche Funktionen der in Blick genommenen Faktoren für die Funktionalität reifer Beta-Zellen gezogen werden sollen. Über ggf. veränderte mRNA- und Protein-Profile können sich ggf. bereits Hinweise auf ein verändertes Splicing in menschlichen pankreatischen Zellen infolge der Inaktivierung bestimmter Gene ergeben.

Da sowohl Typ-1- als auch Typ-2-Diabetes mellitus offenbar mit Veränderungen im alternativen Splicing bzw. mit einer veränderter Präsenz von Splicing-Faktoren assoziiert sind, soll im folgenden eine Gruppe von Splicing-Faktoren untersucht werden, deren Gene in Beta-Zellen stark exprimiert und in Tumoren des Pankreas dysreguliert sind. Um die Rolle dieser als auch weiterer Splicing-Faktoren in Beta-Zellen besser als bislang zu verstehen, sollen die entsprechenden Gene in hES-Zellen funktional inaktiviert und die jeweiligen Effekte auf die Differenzierung, Reifung und Funktion von aus diesen Zellen abgeleiteten Beta-Zellen untersucht werden. Dabei soll auch bestimmt werden, in welchem Stadium der Entwicklung pankreatischer Zellen eine Inaktivierung von Genen für Splicing-Faktoren zu veränderten Eigenschaften der entsprechenden (Vorläufer)Zellen führt, ob und in welcher Weise die Entwicklung in verschiedene pankreatische Zelltypen beeinträchtigt oder begünstigt wird und inwieweit eine Redundanz in der Funktion bestimmter Splicing-Faktoren besteht. Um tiefere Einblicke in die Ursachen der infolge der Inaktivierung von Splicing-Faktor-Genen möglicherweise veränderten zellulären Prozesse zu erhalten, sollen schließlich die Ziel-RNAs spezifischer Splicing-Faktoren in Beta-Zellen identifiziert, die konkreten Veränderungen in den Splicing-Profilen der RNAs bestimmt sowie die entsprechenden Gene inaktiviert und die Konsequenzen für den Differenzierungsprozess und auf die Eigenschaften der pankreatischen Zellen analysiert werden. Diese Untersuchungen werden voraussichtlich wichtige Erkenntnisse über die Funktionen des alternativen Splicing für die Reifung und Funktionalität menschlicher pankreatischer Zellen und über die Konsequenzen einer veränderten Aktivität wesentlicher Splicing-Faktoren für die Entwicklung, Reifung und Funktion des humanen Pankreas erbringen.

Ferner soll die Funktion der Transkriptionsfaktoren MAFA und MAFB in humanen Beta-Zellen näher untersucht werden. Aus den hierzu geplanten Untersuchungen werden neue Erkenntnisse über die Funktion von MAFA in (sich entwickelnden und in reifen) Beta-Zellen des Menschen, über die molekularen Konsequenzen von (ggf. mit Erkrankungen des Pankreas assoziierten) Mutationen im MAFA-Gen sowie über das Zusammenspiel verschiedener Transkriptionsfaktoren der MAF-Familie bei der Entwicklung und Funktion humaner pankreatischer Zellen erwartet. Insbesondere können auch Kenntnisse darüber erlangt werden, über welche Interaktionspartner und Zielgene die MAF-Transkriptionsfaktoren ihre Effekte auf die pankreatische Entwicklung ausüben, was zu neuen Erkenntnissen über die Pankreas-Entwicklung beim Menschen führen kann.

Im weiteren soll untersucht werden, ob und inwieweit die funktionale Integrität eines bestimmten Enzyms für die Funktionalität von Beta-Zellen essentiell ist, da eine Funktionsverlustmutante des entsprechenden Gens mit mitochondrialer Dysfunktion und Hyperglykämie einhergeht und die Präsenz und funktionale Integrität des Genproduktes für das Überleben muriner Beta-Zellen essentiell ist. Durch einen (ggf. konditionellen) funktionalen Knockout des Gens bzw. dessen Überexpression in hES-Zellen und in sich aus diesen entwickelnden pankreatischen Zellen sollen der Einfluss des Enzyms auf die Differenzierung und Reifung der Zellen sowie seine Effekte auf die Elektronentransportkette und auf den Citrat-Zyklus bestimmt werden. Ziel der Überexpressionsstudien ist die Klärung der Frage, ob eine verstärkte Präsenz des Enzyms, ggf. bereits während früher Differenzierungsschritte, zu reiferen Beta-Zellen mit stärker authentischen metabolischen Funktionen führt. Diese Arbeiten sollen insgesamt zu einem besseren Verständnis spezifischer metabolischer Prozesse in menschlichen pankreatischen Zellen beitragen, wobei die erwarteten Resultate ggf. auch für die Optimierung von In-vitro-Differenzierungsprotokollen relevant sind, mit denen reifere pankreatische Zellen aus hES-Zellen gewonnen werden können als es bislang möglich ist.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass die Forschungsfragen in allen wesentlichen Punkten weitestmöglich vorgeklärt sind.

Die essentielle Rolle der zunächst zu untersuchenden Transkriptionsfaktoren für die Beta-Zell-Differenzierung, insbesondere für die Aufrechterhaltung des Pools an pankreatischen Vorläuferzellen, ist für das murine und das humane System in der Vergangenheit umfangreich untersucht und durch zahlreiche Publikationen belegt worden. Hinweise darauf, dass diese Faktoren auch das alternative Splicing regulieren, liegen aus einer Studie mit humanen Zellen vor.

Die Funktion der dann in Blick genommenen Splicing-Faktoren beim konstitutiven und alternativen Splicing ist in der Literatur ebenfalls gut belegt, wobei für einen dieser Faktoren in immortalisierten humanen Beta-Zellen bereits ein breites Spektrum von spezifischen RNA-Bindungsstellen und somit zahlreiche target-RNAs identifiziert worden sind. Voruntersuchungen des für die Forschung verantwortlichen Wissenschaftlers belegen die Präsenz von wenigstens vier verschiedenen dieser Faktoren in humanen pankreatischen Zellen. Veränderungen im Splicing kritischer RNAs sowie die Dysregulation bestimmter Splicing-Faktoren sind überdies bekanntermaßen mit Typ-1- bzw. Typ-2-Diabetes assoziiert.

Zur Frage der Rolle von Transkriptionsfaktoren der MAF-Familie für die Entwicklung und Funktion pankreatischer Zellen sind ebenfalls umfangreiche Studien durchgeführt und publiziert worden. MAFB wird in Alpha- und Beta-Zellen des sich entwickelnden Maus-Pankreas exprimiert, wobei die Expression im adulten Maus-Pankreas auf Alpha-Zellen beschränkt ist. Es wird derzeit davon ausgegangen, dass im adulten Maus-Pankreas allein MAFA die Integrität und die Funktionalität von Beta-Zellen reguliert. Hingegen wurde kürzlich in einer Studie des für die Forschung verantwortlichen Wissenschaftlers gezeigt, dass MAFB essentiell für die Differenzierung humaner Beta-Zellen aus pluripotenten Stammzellen ist, wobei ein Knockout des MAFB-Gens insbesondere zum Verlust der Fähigkeit früher pankreatischer Vorläufer zur Entwicklung in reife Beta-Zellen führt. Die Frage nach der Funktion des ebenfalls in adulten Beta-Zellen des Menschen vorhandenen MAFA ist hingegen nicht hinreichend bekannt. Allerdings scheinen im adulten menschlichen Pankreas sowohl Beta-Zellen mit starker Präsenz von MAFA (und PDX1) als auch Beta-Zellen mit einer vergleichsweise niedrigen Expression der beiden Transkriptionsfaktor-Gene nebeneinander zu existieren und gemeinsam die Funktionalität pankreatischer Inseln zu gewährleisten.

Die Funktionen des hier zu untersuchenden Enzyms als Regulator des Citrat-Zyklus und der oxidativen Phosphorylierung sind durch entsprechende Literatur belegt, insbesondere mit Blick auf die Entwicklung des multiplen mitochondrialen Dysfunktionssyndroms (MMDS) bei Vorliegen einer Funktionsverlust-Mutation. Da MMDS mit Hyperglykämie assoziiert ist, liegt ein Zusammenhang zwischen einer Fehlfunktion des Pankreas und Mutationen in dem hier interessierenden Gen nahe. Zudem haben Vorarbeiten des für die Forschung verantwortlichen Wissenschaftlers, die außerhalb Deutschlands unter Verwendung von hES-Zellen durchgeführt wurden, Hinweise darauf erbracht, dass die Beta-Zell-Reifung mit einer Zunahme des Levels des hier interessierenden Enzyms einhergeht.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Das Ziel der beantragten Forschungsarbeiten ist die Gewinnung neuer Erkenntnisse über Prozesse der Differenzierung, Reifung und Funktion menschlicher pankreatischer Zellen, insbesondere von insulinproduzierenden Beta-Zellen. Zudem sollen die Untersuchungen Voraussetzungen für Gewebeersatz-Therapien zur Behandlung von Patienten mit Diabetes mellitus schaffen helfen. Die Nutzung von Beta-Zellen aus anderen Spezies als dem Menschen kommt nach derzeitigem Kenntnisstand für Transplantationszwecke nicht in Frage. Hierfür sind humane Zellen erforderlich, folglich müssen bereits die Forschungsarbeiten an menschlichen Zellen durchgeführt werden. Zudem bestehen Unterschiede in den molekularen Grundlagen der pankreatischen Zelldifferenzierung und in der Struktur des Pankreas zwischen verschiedenen Spezies, auf die im Antrag detailliert eingegangen wurde, so dass die Erreichung der Forschungsziele auch aus diesem Grunde die Verwendung menschlicher Zellen erfordert.

Da im Forschungsvorhaben auch frühe Entwicklungsprozesse menschlicher pankreatischer Zellen untersucht werden sollen, ist die Nutzung anderer als pluripotenter Stammzellen für die Erreichung der Forschungsziele dieser Projektteile ausgeschlossen: alle anderen menschlichen Stammzelltypen haben die hier interessierenden Entwicklungsstufen bereits durchlaufen. Zwar wäre es denkbar, bestimmte Prozesse der Reifung pankreatischer Zellen auch unter Nutzung eines anderen Zellmaterials zu untersuchen. Hinweise darauf, dass beispielsweise adulte Stammzellen des Menschen in Kultur zu den hier erforderlichen Zellmengen vermehrt und zu Beta-Zellen differenziert werden könnten, liegen jedoch bislang nicht vor. Eine Nutzung von Stammzellen aus abgetriebenen menschlichen Föten ist zwar denkbar, jedoch aufgrund von deren geringer Verfügbarkeit und Reproduzierbarkeit ausgeschlossen. Fragen nach den Eigenschaften und dem In-vitro-Differenzierungspotential fötaler pankreatischer Zellen des Menschen sind zudem weitgehend ungeklärt. Hinzu kommt, dass von all diesen Zellen nicht hinreichend bekannt ist, ob und in welchem Maße sie den für die Projektdurchführung essentiellen umfangreichen genetischen Veränderungen zugänglich sind.

Die Erreichung der Forschungsziele ist nach derzeitigem Kenntnisstand auch nicht unter Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) möglich. Zwar wurden auch hiPS-Zellen bereits zur Herstellung pankreatischer Beta-Zellen eingesetzt, jedoch haben hiPS-Zellen ein stark variierendes und deutlich geringeres pankreatisches Differenzierungspotential als die hier zur Verwendung vorgesehenen hES-Zellen. Es ist auch nicht hinreichend geklärt, welche Konsequenzen die in manchen Studien beobachteten und infolge des Reprogrammierungsprozesses auftretenden genetischen Veränderungen und das für hiPS-Zellen postulierte epigenetische Gedächtnis für das pankreatische Differenzierungspotential von hiPS-Zellen haben. Auch die Frage danach, in welchem Umfang der Reprogrammierungsprozess zu genetischen Veränderungen führt, ist weiterhin strittig. Eine jüngst publizierte Studie hat erneut starke Anhaltspunkte dafür geliefert, dass ein Großteil der hiPS-Zellen in den zur Reprogrammierung genutzten Zellen präsente somatische oder später erworbene Mutationen aufweist. Zudem wurde in einer der wenigen publizierten Studien, in denen hES- als auch hiPS-Zellen parallel in funktionale Beta-Zellen differenziert und ausgiebig charakterisiert wurden, ausdrücklich eine geringere Effizienz der pankreatischen Differenzierung festgestellt, wenn hiPS-Zellen verwendet wurden.

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