176. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber

Herr Professor Christian Schachtrup, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg.

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linie:

• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten ist die Untersuchung der Fragestellung, ob und inwieweit durch Ausschaltung des Gens, das für den Inhibitor of DNA binding 3 (ID3) codiert, die Differenzierung humaner neuraler Stammzellen (NSZ) zu reaktiven Astrozyten unterbunden werden kann. Die Untersuchungen erfolgen vor dem Hintergrund, dass sich bei Verletzungen des Zentralnervensystems der Maus die NSZ an der Läsionsstelle zu reaktiven Astrozyten entwickeln, die dann zur Narbenbildung beitragen und durch Sekretion inhibitorischer Proteine das axonale Wachstum der lädierten Neurone hemmen. NSZ, die im Stadium glialer Vorläuferzellen verbleiben, können hingegen durch Sekretion von Wachstums- und immunmodulatorischen Faktoren zur Bildung einer stärker pro-regenerativen Umgebung beitragen und so das axonale Wachstum fördern. Daher sollen – nachdem eine geeignete Methode für die Differenzierung von hES-Zellen zu NSZ etabliert und optimiert wurde – das ID3-Gen in hES-Zellen ausgeschaltet, die genetisch veränderten hES-Zellen zu NSZ differenziert und deren Potential untersucht werden, sich in vitro entweder zu reaktiven Astrozyten zu differenzieren oder aber sich in Richtung pro-regenerativer glialer Vorläuferzellen zu entwickeln. Die NSZ-Populationen sollen nach umfassender In-vitro-Charakterisierung in ein Mausmodell für Rückenmarksverletzungen transplantiert und die Effekte auf die Wiederherstellung sensorischer, motorischer und autonomer Funktionen untersucht werden. Dabei sollen die weitere Entwicklung der transplantierten NSZ an der Grenze zur (endogenen) glialen Narbe, ein möglicher Einfluss der NSZ auf die endogenen murinen Astrozyten im Läsionsgebiet und potentielle Effekte auf die Regeneration aufsteigender sensorischer Neurone und absteigender Axone des Kortikospinaltrakts bestimmt werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) sowohl der Erreichung hochrangiger Forschungsziele in der Grundlagenforschung als auch der Schaffung von Grundlagen für die Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren zur Anwendung bei Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Eine Regeneration von Nervengewebe findet im adulten Zentralnervensystem, beispielsweise nach Rückenmarksverletzung, nur in unzureichendem Maße statt. Eine Therapieoption für derartige Verletzungen besteht in der Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen abgeleiteten neuralen Stammzellen (NSZ) in die Läsionsstelle, was sich als vielversprechend für die Verbesserung der Neuroprotektion und für die neuronale Regeneration erwiesen hat. Transplantierte neurale Stammzellen neigen infolge der spezifischen zellulären und molekularen Bedingungen an der Läsionsstelle allerdings dazu, sich in Richtung reaktiver Astrozyten zu entwickeln. Diese tragen zur Narbenbildung bei und sekretieren inhibitorische Proteine, die das axonale Wachstum der Neurone nach Rückenmarksverletzungen hemmen. Verbleiben die transplantierten Zellen hingegen im Stadium glialer Vorläuferzellen, können sie zur Etablierung einer pro-regenerativen Zellumgebung beitragen und – beispielsweise durch die Sekretion von Wachstums- und immunmodulierenden Faktoren – die axonale Regeneration fördern.

Die molekularen Vorgänge, durch die bei ZNS-Schädigungen eine vornehmliche Differenzierung von NSZ zu reaktiven Astrozyten bei gleichzeitiger Verringerung von deren neuronaler Differenzierung ausgelöst wird, sind im murinen System bereits erforscht worden. Dabei wurde u.a. eine Anreicherung von Fibrinogen an der Läsionsstelle beobachtet, was zu einer Aktivierung des BMP-Signalweges in NSZ und in der Folge zur Aktivierung der Expression des Id3-Gens führt. Id3 bewirkt dann eine Verminderung der Aktivität des (inhibitorischen) Transkriptionsfaktors E47, der normalerweise die Expression astrozytenspezifischer Gene wie Gfap und Glast hemmt. In der Folge kommt es zu einer präferentiellen Entwicklung der NSZ in Richtung reaktiver Astrozyten. Eine funktionale Inaktivierung von Id3 in der Maus führte zu einer verminderten BMP2-induzierten Entstehung reaktiver Astrozyten infolge von ZNS-Verletzungen.

Ziel der Forschungsarbeiten ist es nunmehr, die in der Maus erworbenen Erkenntnisse im humanen System zu überprüfen und zu klären, ob die Inaktivierung des ID3-Gens auch bei humanen NSZ zu einer verminderten Fähigkeit zur Entwicklung in reaktive Astrozyten führt und ob dadurch die vorwiegende Entstehung proregenerativer NSZ begünstigt wird. Hierfür sollen zunächst Bedingungen für eine optimierte Differenzierung humaner ES-Zellen zu NSZ mit einem hohen Anteil glialer Vorläuferzellen etabliert werden, in deren Ergebnis bereits eine ggf. verbesserte Vorgehensweise zur Gewinnung neuraler Vorläuferpopulationen mit einem ausgeprägten glialen Differenzierungsvermögen verfügbar sein könnten, was bereits einen relevanten Erkenntnisfortschritt darstellen würde.

Ferner soll das Gen für den Transkriptionsfaktor ID3 in hES-Zellen biallelisch inaktiviert und anschließend überprüft werden, ob und auf welche Weise sich hierdurch das Potential der hES-Zellen zur Differenzierung in reaktive bzw. pro-regenerative Astrozyten verändert. Nach Etablierung genetisch modifizierter Zellen und Verifizierung der ID3-Gen-Inaktivierung soll überprüft werden, welche Eigenschaften die aus diesen Zellen abgeleiteten NSZ insbesondere hinsichtlich ihres Expressionsprofils auf RNA- und Protein-Ebene und ihres glialen Differenzierungspotentials aufweisen. Zudem soll geklärt werden, ob andere Proteine der ID-Familie nach Inaktivierung des ID3-Gens ggf. stärker exprimiert werden und den Verlust von ID3 kompensieren. Zudem soll überprüft werden, ob die Inaktivierung des ID3-Gens eine verminderte Fähigkeit der NSZ bedingt, sich infolge der Behandlung mit Fibrinogen zu reaktiven Astrozyten zu entwickeln. Diese Arbeiten werden aller Voraussicht nach neue Erkenntnisse darüber erbringen, ob ein funktionaler knock out des ID3-Gens ein gangbarerer Weg ist, die durch Fibrinogen induzierte Entwicklung von NSZ in Richtung reaktiver Astrozyten auch im humanen System spezifisch zu hemmen, ohne deren Fähigkeit einzuschränken, als proregenerative gliale Zellen zu fungieren.

Schließlich sollen die hinsichtlich des ID3-Gens modifizierten NSZ in ein transgenes Mausmodell für Rückenmarksverletzungen transplantiert werden. Nach Transplantation soll zum einen die weitere Entwicklung der transplantierten Zellen in der Läsionsstelle beobachtet und deren Überleben, Integration und Reifung bewertet werden, beispielsweise durch Analyse ihrer weiteren Differenzierung, ihrer Morphologie, ihrer Position und ggf. ihrer Integration in die gliale Narbe. Ferner sollen die Effekte der Transplantate auf die Regeneration aufsteigender sensorischer Axone und absteigender serotonerger Axone untersucht und Veränderungen der sensorischen, motorischen und autonomen Funktionen der Tiere bestimmt werden. Dies soll Erkenntnisse darüber erbringen, ob und inwieweit ein knock out des ID3-Gens zu NSZ führt, die nach Transplantation in ein relevantes Tiermodell für spinales Trauma zu einer gegenüber der Nutzung genetisch unveränderter NSZ verbesserten Regeneration des Nervengewebes führt.

Insgesamt werden die Forschungsarbeiten Erkenntnisse darüber erbringen, ob die durch Fibrinogen bedingte Differenzierung von NSZ zu reaktiven Astrozyten auch in menschlichen Zellen durch einen funktionalen knock out des ID3-Gens verhindert und dieses Konzept für die Gewinnung entsprechend resistenter NSZ genutzt werden kann. Indirekt ergeben sich Erkenntnisse über die Funktionalität der Fibrinogen-ID3-Achse im Menschen und deren Relevanz für die Differenzierung von neuralen Stammzellen zu Astrozyten. Zudem sind traumatische Rückenmarksverletzungen, die mit akutem und progressivem Verlust von Nervenzellen einhergehen, häufig mit einer erheblichen Einschränkung oder einem partiellen oder vollständigen Verlust der autonomen, sensorischen und motorischen Leistungsfähigkeit des Patienten verbunden. Die im Forschungsvorhaben angestrebte mittelfristige Entwicklung eines neuartigen Therapiekonzeptes für diese bislang nicht heilbaren Verletzungen ist ebenfalls ein hochrangiges Forschungsziel.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass die Forschungsfragen in allen wesentlichen Punkten weitestmöglich vorgeklärt sind.

Die Fähigkeit von hES-Zellen, in vitro zu neuralen Stammzellen mit einem hohen astroglialen Potential sowie zu verschiedenen Subpopulationen von Astrozyten zu differenzieren, wurde in der Vergangenheit umfassend untersucht. Folglich liegen verschiedene publizierte Protokolle für ein entsprechendes experimentelles Vorgehen vor, auf die der Genehmigungsinhaber zurückgreifen kann.

Die Rollen von Fibrinogen, Bmp2, Id3 und E47 bei der Entstehung reaktiver Astrozyten im Zusammenhang mit Verletzungen des ZNS wurden in mehreren Studien unter Nutzung muriner Zell- und Tiermodelle umfassend untersucht. Darin wurde Id3 als der über den BMP-Signalweg aktivierte Transkriptionsregulator identifiziert, der nach ZNS-Schädigung die Differenzierung von NSZ in reaktive Astrozyten fördert. Eine Schädigung des Kortex führte in der Maus zu einer Anreicherung von Id3 in der Stammzellnische, und ein biallelischer knock out des Id3-Gens verhinderte die Bmp2-induzierte Differenzierung neuraler Vorläuferzellen der Maus in reaktive Astrozyten in vitro und in vivo. Als für die Id3-Effekte maßgeblich wurde der (inhibitorische) bHLH-Transkriptionsfaktor E47 identifiziert. Ferner wurde eine erhebliche Anreicherung des Koagulationsfaktors Fibrinogen in der Stammzellnische der subventrikulären Zone beobachtet, was über eine Aktivierung des Bmp-Signalweges die Differenzierung in Neurone hemmte und jene in Astrozyten beförderte.

Das zur Anwendung kommende Mausmodell für Verletzungen des Rückenmarks ist gut etabliert. Die Transplantation von neuralen Vorläuferzellen in derartige Tiermodelle ist eine Standard-Methode, die vielfach in publizierten Studien zur Anwendung kam. Weitere für die Klärung der Forschungsfragen geplante Vorgehensweisen, beispielsweise zur genetischen Veränderung der hES-Zellen und zur Charakterisierung neuronaler und glialer Vorläuferzellen, sind gut etabliert.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Erreichung der Forschungsziele erfordert die Nutzung menschlicher Zellen. Ziel der Forschungsarbeiten ist zum einen die Verifizierung von in der Maus gewonnenen Erkenntnissen über die Differenzierung von NSZ zu Astrozyten in einem relevanten humanen System. Zum anderen soll überprüft werden, ob die Transplantation von humanen NSZ, in denen das ID3-Gen ausgeschaltet ist, gegenüber Wildtyp-Zellen verbesserte regenerative Effekte bei Rückenmarksverletzungen hat. Diese Untersuchungen erfolgen in Hinblick auf die spätere Anwendbarkeit der Ergebnisse zur Behandlung von Rückenmarksverletzungen beim Menschen; hierfür ist die Nutzung menschlicher Zellen erforderlich.

Die Forschungsziele können nach gegenwärtigem Kenntnisstand auch nicht unter Nutzung anderer als pluripotenter menschlicher Zellen erreicht werden. Menschliche neurale Stammzellen können zwar aus abgetriebenen Föten, aus post-mortem-Gewebe sowie aus Biopsien der subventrikulären oder der hippokampalen subgranulären Zone gewonnen werden. Allerdings haben diese bezüglich ihrer weiteren Entwicklung meist bereits determinierten Zellen ein im Vergleich zu pluripotenten Stammzellen geringeres neurales Differenzierungsvermögen; die Frage danach, ob sie zu den hier angestrebten NSZ mit einem ausgeprägten astroglialen Differenzierungspotential differenziert bzw. als solche angereichert werden können, ist nicht geklärt. Zudem stehen derartige Zellen nicht in der für die Durchführung der Forschungsarbeiten erforderlichen Menge sowie in nicht oder nur unzureichend reproduzierbarer Weise zur Verfügung. Ferner sind diese Zellen den für die erfolgreiche Projektdurchführung zwingend erforderlichen genetischen Veränderungen weniger gut zugänglich als pluripotente Stammzellen.

Die Forschungsziele können nach gegenwärtigem Kenntnisstand auch nicht unter Nutzung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) geklärt werden. hiPS-Zellen haben – anders als die zur Nutzung vorgesehenen hES-Zellen – ein äußerst variables neurales Differenzierungspotential, dessen Ursachen weiterhin unzureichend geklärt sind. Hinzu kommen epigenetische Unterschiede zu hES-Zellen sowie Mutationen, die entweder aus der zur Herstellung der hiPS-Zellen genutzten somatischen Zellen stammen oder aber im Prozess der Reprogrammierung erworben wurden. Da ein zentrales Ziel des Forschungsvorhabens in der Untersuchung der Effekte des knock out eines spezifischen Gens (ID3) besteht, sind Ausgangszellen mit einem definierten genetischen Hintergrund, für die zudem umfangreiche Erfahrungen hinsichtlich der Differenzierung in transplantierbare NSZ bestehen (hier: hES-Zell-Linie H9), von erheblicher Bedeutung.

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