175. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber

Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, Dortmund.

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• ESI-017 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• MEL-1 (University of Queensland, Melbourne, Australien)
• RUES2 (Rockefeller University, New York, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der Forschungsarbeiten ist die Ergründung der molekularen Mechanismen, die die artspezifische Dynamik der Zelldifferenzierung regulieren. Dies soll durch vergleichende Analysen an murinen und humanen embryonalen Stammzellen erfolgen, wofür in einem ersten Teilprojekt u.a. ein experimentelles System auf der Basis von hES-Zellen etabliert werden soll. Um extrinsische Ursachen für die beträchtlichen artspezifischen Unterschiede in der Differenzierungsgeschwindigkeit ausschließen zu können, sollen dabei Kulturbedingungen entwickelt und validiert werden, unter denen ES-Zellen der Maus und des Menschen vergleichbare Wachstumsraten unter Beibehaltung der für die Pluripotenz wesentlichen Eigenschaften aufweisen. Um Unterschiede im Differenzierungsmedium als für unterschiedliche Differenzierungsdynamiken ursächlich ausschließen zu können, sollen auch die Bedingungen für die Differenzierung humaner und muriner ES-Zellen in Richtung neuroektodermaler und mesodermaler Vorläuferzellen vereinheitlicht werden. Ferner sollen auf der Basis muriner und humaner ES-Zellen mehrfach transgene Reporter-Zellinien hergestellt werden, die eine Visualisierung des Differenzierungsfortschritts erlauben, und ein experimentelles System zur Messung des zellulären Energieumsatzes in pluripotenten und sich differenzierenden Stammzellen entwickelt werden. In einem zweiten Teilprojekt soll der zelluläre Metabolismus dann durch verschiedene Inhibitoren gehemmt oder durch genetische Manipulation der Zellen aktiviert und die Effekte auf Pluripotenz und Differenzierungsgeschwindigkeiten bestimmt werden. Durch Sequenzierung von Einzelzell-Transkriptomen sollen mögliche Unterschiede in Ausmaß und Dynamik der Expression orthologer Gene in murinen und humanen Zellen bestimmt werden, die mit Zellstoffwechsel und Chromatinmodifikation in Zusammenhang stehen. Dabei identifizierte Kandidatengene sollen dann in pluripotenten und sich differenzierenden Zellen überexprimiert bzw. in ihrer Expression gehemmt und die Effekte auf Pluripotenz, metabolische Aktivität und Differenzierungsdynamik ermittelt werden. Ziel ist die Identifizierung und Validierung von Genen, deren Produkte über eine Modulation der metabolischen Aktivität die Differenzierungsgeschwindigkeit beeinflussen können. Im weiteren sollen ggf. auch pluripotente Stammzellen weiterer Spezies in die Untersuchungen einbezogen werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) in erster Linie der Erreichung hochrangiger Forschungsziele in der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Ziel der beantragten Forschungsarbeiten ist die Aufklärung der molekularen und zellulären Grundlagen von artspezifischen Dynamiken von Zelldifferenzierungsprozessen während der Embryonalentwicklung, die sich in analoger Weise auch in sich differenzierenden pluripotenten Stammzellen manifestieren. Die Ursachen für diesbezügliche speziesspezifische Unterschiede können zumindest in Teilen in genetisch und epigenetisch bedingten Besonderheiten im jeweiligen Zell- und Energiestoffwechsel des sich entwickelnden Embryos liegen, was durch vergleichende Untersuchungen des Metabolismus sich differenzierender pluripotenter Stammzellen verschiedener Spezies belegt werden soll.

In einem ersten Projektteil sollen durch Entwicklung harmonisierter Kultur- und Differenzierungsmedien die Voraussetzungen dafür geschaffen werden, den Energiestoffwechsel humaner und muriner ES-Zellen sowie der sich aus diesen Zellen entwickelnden neuroektodermalen und mesodermalen Zellen unabhängig von einem ggf. maßgeblichen Einfluss extrinsischer Bedingungen zu analysieren. Zudem sollen in diesem Projektteil geeignete Reporter-Zellinien für die präzise Analyse der Differenzierungsvorgänge hergestellt und ein geeignetes experimentelles System für die Messung des Energieumsatzes in pluripotenten Stammzellen und aus diesen abgeleiteten Zellen etabliert werden. Mit der angestrebten Etablierung einheitlicher Bedingungen für die Kultivierung und Differenzierung pluripotenter Stammzellen von Maus und Mensch wird der Einfluss extrinsischer Bedingungen auf das Wachstum und die Differenzierungsgeschwindigkeit weitgehend ausgeschlossen, was für die geplante vergleichende Untersuchung des Energieumsatzes der Zellen während ihrer Differenzierung von entscheidender Bedeutung ist. Zudem werden im Ergebnis der Arbeiten gut charakterisierte, teils mehrfach transgene Reporter-Zell-Linien zur Differenzierungsanalyse vorliegen, ferner ein experimentelles System, mit dem der zelluläre Energieumsatz in pluripotenten Stammzellen und während der Differenzierung bestimmt werden. Dies ist Voraussetzung zur Klärung der hier aufgeworfenen Forschungsfragen; jedoch können diese Systeme künftig auch für andere Fragestellungen von anderen Forschergruppen genutzt werden.

Im Anschluss soll der prinzipielle Nachweis erbracht werden, dass eine veränderte Rate des zellulären Energieumsatzes infolge genetischer und pharmakologischer Interventionen zu einer Veränderung der Differenzierungsgeschwindigkeit führt. Hierfür wird u.a. zum einen die Aktivität ratenlimitierender Enzyme vermindert und der Proteinmetabolismus durch spezifische Pharmaka moduliert, andererseits durch Überexpression spezifischer Gene die metabolische Aktivität verstärkt. Die Effekte dieser Manipulationen auf den zellulären Metabolismus, auf die Wachstumsrate, auf die Eigenschaften und auf die Differenzierungs-Dynamik sollen dann auf Einzelzellebene bestimmt und Rückschlüsse darauf gezogen werden, in welchem Maße ein veränderter Metabolismus zu Veränderungen in der Dynamik der Zelldifferenzierung führt. Die Arbeiten sollen Erkenntnisse darüber erbringen, ob pluripotente Stammzellen die gleichen artspezifischen Unterschiede in ihrer metabolischen Rate zeigen wie differenzierte Zellen in Geweben des adulten Organismus. Die geplante Manipulation des Zellmetabolismus wird aller Voraussicht nach kausale Zusammenhänge zwischen der metabolischen Rate und der Dynamik der Zelldifferenzierung aufdecken; durch die Messung von zellulärem Metabolismus bei gleichzeitiger Bestimmung der Differenzierungsgeschwindigkeit kann aller Voraussicht nach zum Verständnis der Rolle des zellulären Metabolismus für entwicklungsbiologische Prozesse beigetragen werden.

Ferner sollen die dem Zusammenhang zwischen zellulärem Energieumsatz und der Differenzierungsdynamik zugrundeliegenden genetischen Mechanismen untersucht werden. Mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierungen sollen das Expressionsniveau und die Expressionsdynamik orthologer Gene in den Zellen vom Maus und Mensch verglichen und (artspezifisch) differentiell bzw. verzögert exprimierte Gene identifiziert werden, deren Produkte beispielsweise Komponenten metabolischer Netzwerke und daher ggf. am Zustandekommen unterschiedlicher Zelldifferenzierungsgeschwindigkeiten beteiligt sind. Durch Inaktivierung/Hemmung bzw. Überexpression derartiger Gene und anschließende Messung des zellulären Energieumsatzes während der Differenzierung soll eine mögliche Funktion der jeweiligen Genprodukte an der Kontrolle des speziesspezifischen zellulären Energieumsatzes, an der Regulation der Differenzierungsdynamik und/oder an dem mit der Differenzierung einhergehenden tiefgreifenden Umbau des Epigenoms bestätigt werden. Dadurch können voraussichtlich Gene identifiziert werden, deren Produkte maßgeblich an der Kontrolle der (artspezifischen) Dynamik der neuroektodermalen Differenzierung beteiligt sind. Dies wäre ein erheblicher Beitrag zum Verständnis der genetischen und molekularbiologischen Grundlagen von Unterschieden in der Entwicklungsdynamik verschiedener Spezies. Im Falle der Identifizierung von für die Differenzierungsdynamik relevanten Genen soll im weiteren überprüft werden, ob die dabei erzielten Erkenntnisse sich auch auf andere Spezies ausdehnen lassen und ob zu den identifizierten Genen orthologe Gene in anderen Säugern dieselbe oder eine ähnliche Bedeutung für die Differenzierungsdynamik haben. Aus diesen Untersuchungen werden Erkenntnisse darüber erwartet, ob die im murinen und humanen System erarbeiteten Forschungsergebnisse von stärker genereller Natur sind und auch für andere Spezies Gültigkeit haben.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Grundlegende Unterschiede in der Entwicklungsgeschwindigkeit verschiedener Säugetierspezies sind seit vielen Jahren aus embryologischen Studien bekannt. Der Nachweis, dass durch Nutzung pluripotenter Stammzellen artspezifische Unterschiede in der Dynamik der Embryonalentwicklung rekapituliert werden können, wurde vor einigen Jahren erbracht. Kürzlich wurde zudem ein direkter Vergleich der Entwicklungsgeschwindigkeit von Motoneuronen in humanen und murinen Embryonen durchgeführt und publiziert, bei dem Unterschiede in der Proteinstabilität als ein Mechanismus verschiedener Entwicklungsgeschwindigkeiten festgestellt wurden, deren Ursache jedoch nicht bekannt ist. Unterschiede zwischen humanen und murinen Zellen konnten außerdem für die Geschwindigkeit der Segmentierung des paraxialen Mesoderms und der Somiten-Bildung nachgewiesen werden. Diese Arbeiten legen nahe, dass artspezifische Entwicklungsgeschwindigkeiten durch die In-vitro-Differenzierung pluripotenter Stammzellen rekapituliert werden können. Die geplanten Manipulationen der metabolischen Aktivität, von denen angenommen wird, dass sie mit Pluripotenz der Zellen interferieren bzw. zu einer veränderten Entwicklungsgeschwindigkeit oder Differenzierungsrate führen und die hier durch genetische Veränderungen oder pharmakologisch wirksame Substanzen erreicht werden sollen, wurden ebenfalls bereits in der Vergangenheit genutzt und sind vorgeklärt.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten soll die Frage geklärt werden, ob spezies-spezifische metabolische Charakteristika die Differenzierungsgeschwindigkeit regulieren und welche genetischen und molekularen Mechanismen dieser Regulation zugrundeliegen. Diese Arbeiten sollen mit dem Ziel durchgeführt werden, die Kontrolle der Differenzierungsdynamik in den Zellen von Maus und Mensch zu verstehen, was die ausschließliche Nutzung tierischer Zellen zur Klärung der Forschungsfrage ausschließt und gleichzeitig die Verwendung menschlicher Zellen erforderlich macht. Da sich die Untersuchungen auf Fragen der Erhaltung der Pluripotenz und auf frühe Entwicklungsvorgänge (insbesondere während der neuroektodermalen Differenzierung) konzentrieren, ist die Verwendung pluripotenter Stammzellen erforderlich. Andere verfügbare Zellen des Menschen haben die hier interessierenden Entwicklungsstadien bereits durchlaufen.

Die Forschungsziele können nach gegenwärtigem Kenntnisstand auch nicht unter ausschließlicher Nutzung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen geklärt werden. hES-Zellen und hiPS-Zellen weisen unter vergleichbaren Kulturbedingungen charakteristische Unterschiede in ihrem Metabolom auf, was die Differenzierungsgeschwindigkeit von hiPS- im Vergleich zu hES-Zellen beeinflussen und die Aussagekraft der mit hiPS-Zellen erlangten Ergebnisse einschränken könnte. Das Differenzierungsverhalten wie auch die Differenzierungsdynamik pluripotenter Stammzellen werden zudem maßgeblich durch das Epigenom beeinflusst. hiPS-Zellen weisen jedoch im Gegensatz zu hES-Zellen reprogrammierungsbedingte epigenetische Veränderungen auf, deren Effekte auf die hier interessierenden Parameter nicht bekannt sind. Ferner sollen für die Messung der Zelldifferenzierungsgeschwindigkeit verschiedene Reportergensysteme eingesetzt werden, die in hES-Zellen bereits teilweise etabliert und charakterisiert wurden, während sie auf Grundlage von hiPS-Zellen nicht oder nicht in gleichem Umfang verfügbar sind. Da die Prüfung der Notwendigkeit der Verwendung von hES-Zellen stets auf Grundlage des aktuellen (und nicht der Basis eines ggf. in Zukunft zu schaffenden) Kenntnisstandes zu erfolgen hat, ist die Verwendung von hES-Zellen bereits aus dem letztgenannten Grund erforderlich.

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