169. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber

Universitätsklinikum Essen

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H7 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-4 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• I3 (Technion - Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I4 (Technion - Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I6 (Technion - Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• KhES-1 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan)
• KhES-2 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan)
• KhES-3 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Die genehmigten Forschungsarbeiten sollen zur Klärung der Frage beitragen, in welchem Ausmaß und auf welchem Wege die Interaktion von Zellen eines Retinoblastoms mit den Zellen der Retina sowie mit anderen Zellen der Tumormikroumgebung die Eigenschaften des Tumors verändern und ggf. zur Resistenz der Tumoren gegen Arzneimittel führen. Zu diesem Zweck soll ein Gewebemodell etabliert werden, in dem in vitro aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) differenzierte Retina-Organoide mit Retinoblastom-Zellen in Kontakt gebracht werden, wobei retinale Organoide und Tumorzellen entweder gemeinsam kultiviert oder aber Tumorzellen in die Organoide injiziert werden, jeweils ggf. zusammen mit Zellen mikroglialen Ursprungs.

Die interzellulären Wechselwirkungen sollen auf morphologischer, molekularer und genetischer Ebene umfassend untersucht werden, beispielsweise in Hinblick auf Veränderungen in den Genexpressionsmustern der retinalen Zellen oder in der zellulären Zusammensetzung der Retinoblastome. Rezeptor-Liganden-Interaktionen zwischen Tumorzellen, retinalen Zellen und Mikroglia-Zellen sollen identifiziert und deren Einfluss auf das Transkriptom der jeweiligen Zellen bestimmt werden. Schließlich soll überprüft werden, ob und inwieweit sich die Reaktion von Retinoblastom-Zellen auf die Behandlung mit bestimmten Arzneistoffen in Anwesenheit von retinalen Zellen und Mikroglia verändert, wobei vor allem Apoptose- und Zellzyklus-Parameter bestimmt und Veränderungen im Transkriptom analysiert werden sollen.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) in erster Linie der Erreichung hochrangiger Forschungsziele in der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Das Retinoblastom ist eine fast ausschließlich im Kindesalter auftretende seltene Tumorerkrankung des Auges. Wenn die Erkrankung unbehandelt bleibt, verläuft sie fast immer tödlich. Eine Chemotherapie führt häufig zur Resistenzentwicklung, wobei die Frage danach, wie die Entwicklung von Chemoresistenz in Tumorzellen initiiert wird und welche Rolle hierfür das umgebende retinale Gewebe spielt, gegenwärtig ungeklärt ist. Es wird allerdings vermutet, dass Wechselwirkungen zwischen den Zellen des Retinoblastoms und Zellen der Retina, ggf. unter Beteiligung von Immunzellen (Mikrogliazellen), wesentliche Eigenschaften der Tumorzellen verändern und so zur Entwicklung von Therapieresistenzen führen können.

Mit der geplanten Etablierung eines Tumormodells aus Retinoblastom-Zellen, hES-Zell-abgeleiteten retinalen Organoiden und Zellen der Mikroglia soll die Tumornische von Retinoblastomen in vitro nachgebildet werden, was die Analyse von Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und den sie umgebenden Zellen der Retina ermöglicht. So kann beispielsweise das Ausmaß des invasiven Tumorwachstums in die Retina-Organoide bestimmt und – bei Zusatz humaner Mikrogliazellen – das komplexe Zusammenspiel von Retinoblastom-Zellen mit Zellen der Retina und des Immunsystems untersucht werden. Die Analyse der Integration der Retinoblastom-Zellen in die retinalen Organoide wird voraussichtlich zu neuen Informationen über Interaktionen zwischen Tumorzellen und retinalen Zellen, über die Lokalisation der Retinoblastom-Zellen und Mikrogliazellen innerhalb der retinalen Organoide und über die Effekte führen, die die Wechselwirkungen des Organoids mit den Tumorzellen und Mikrogliazellen auf die Zellen bestimmter Geweberegionen in den Organoiden haben, beispielsweise in Hinblick auf deren Genexpressionsmuster. Ferner sind bioinformatische Simulationen geplant, mit denen Rezeptor-Liganden-Interaktionen identifiziert werden sollen, die zwischen Retinoblastom-Zellen und den Zellen der retinalen Organoide bzw. Mikrogliazellen auftreten. Diese Wechselwirkungen sollen näher charakterisiert, ggf. experimentell gehemmt und mit entsprechenden Daten aus der Analyse primärer humaner Retinoblastome verglichen werden. Zudem sollen auch die Genexpressionsmuster von Tumorzellen in diesem Modell analysiert und Erkenntnisse über den Einfluss von Retina-Zellen und Mikroglia-Zellen auf die Genexpression von Retinoblastom-Zellen erlangt werden. Diese Forschungsarbeiten werden aller Voraussicht nach zu neuen Erkenntnissen über Biologie und Pathogenese des Retinoblastoms beitragen, insbesondere über Interaktionen von Tumorzellen mit Retinazellen bzw. Mikrogliazellen, von denen angenommen wird, dass sie eine zentrale Rolle bei der Resistenzentwicklung gegenüber Chemotherapeutika spielen könnten.

Wesentlich für die Authentizität des Tumormodells (und damit die Reproduktion des Ansprechens auf Medikamente) ist die Erhaltung der Heterogenität der mit den Organoiden gemeinsam kultivierten (primären) Tumoren, die bei isolierter Kultivierung von primären Tumoren in der Regel verlorengeht. Diese soll durch umfangreiche Analysen in Präsenz oder in Abwesenheit von Mikrogliazellen bestimmt und so geklärt werden, ob und inwieweit die zelluläre Heterogenität von Retinoblastom-Zellen nach ihrer Kultur in einem retinalen Organoidmodell erhalten bleibt. Ist dies geklärt, soll das Tumormodell genutzt werden, um die Wirksamkeit von Medikamenten zu untersuchen, die derzeit in der Chemotherapie gegen Retinoblastome eingesetzt werden. Hierfür soll das Tumormodell mit unterschiedlichen Medikamenten behandelt werden, deren Auswirkungen auf die Apoptoserate, den Zellzyklus, das Transkriptom sowie auf das Migrations- und Invasionsverhalten der Tumorzellen untersucht und die Ergebnisse mit Daten verglichen werden, die in herkömmlichen Retinoblastom-Kulturen erhoben wurden, also ohne Präsenz von retinalen und mikroglialen Zellen. Durch vergleichende Analysen des Transkriptoms sollen ggf. Moleküle und Signalwege identifiziert werden, die für veränderte Effekte von Wirkstoffen im hier etablierten komplexen Tumormodell, verglichen zu herkömmlichen Retinoblastom-Kulturen, verantwortlich sind, wodurch Erkenntnisse über Ursachen von Therapieversagen bei Retinoblastomen gewonnen und ggf. Grundlagen für neue Therapieansätze geschaffen werden sollen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Die genehmigten Arbeiten knüpfen an in der Vergangenheit genehmigte Arbeiten an, in denen u.a. die Differenzierungsfähigkeit von hES-Zellen zu Zellen der neuralen Retina untersucht und Vorgehensweisen für die Differenzierung von hES-Zellen in retinale Organoide entwickelt wurden. Zu Fragen nach der zellulären Heterogenität in humanen Retinoblastomen und nach den Wechselwirkungen von Tumorzellen mit Zellen der Retina wurden die Ergebnisse umfangreicher Untersuchungen vorgelegt. Analysen der Transkriptome humaner Retinoblastom-Zellen zeigen, dass diese Tumore sowohl von Immunzellen (v. a. Mikrogliazellen) als auch von gesunden retinalen Zellen durchsetzt sind. Bioinformatische Simulationen von Rezeptor-Liganden-Interaktionen zeigten zudem, dass insbesondere undifferenzierte (bzw. dedifferenzierte) Retinoblastom-Zellen intensiver mit den Zellen in der Umgebung des Tumors interagieren als dies stärker differenzierte Retinoblastom-Zellen tun. Ferner konnte durch die Untersuchung von pädiatrischen Hirntumorentitäten gezeigt werden, dass die Kommunikation von Tumorzellen mit Zellen der Tumormikroumgebung (mit Mikroglia, Makrophagen, Oligodendrozyten) zur Entwicklung von Therapieresistenzen beitragen kann. Zelluläre Interaktionen von Tumorzellen mit infiltrierenden „gesunden“ Zellen sind auch für andere Tumoren in der Literatur beschrieben. So führen beispielsweise synaptische Interaktionen von Zellen eines Glioblastoms mit den Neuronen der Umgebung zu einer verstärkten Proliferation der Tumorzellen. Protokolle für die Herstellung von retinalen Organoiden aus embryonalen Stammzellen des Menschen und der Maus sind in der Literatur beschrieben, Verfahren zur Analyse der zellulären Integration/Interaktion sowie zur Analyse der Effekte von Wirkstoffen sind beim Genehmigungsinhaber etabliert.
Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Das Ziel der Forschungsarbeiten ist die Etablierung eines Organoid-Modells, das die Tumornische des Retinoblastoms in vitro nachbildet und an dem die Wirksamkeit von Tumormedikamenten zur Behandlung des Retinoblastoms besser als bislang möglich überprüft werden und die Grundlagen von Arzneimittel-Resistenzen für diesen Tumor erforscht werden können. Hierfür ist die Nutzung eines humanen Zellmaterials erforderlich, da sich das Retinoblastom insbesondere der Maus in seiner Biologie und Genetik erheblich vom humanen Retinoblastom unterscheidet. So müssen in der Maus neben dem Rb1-Gen weitere Gene wie p107 und p53 ausgeschaltet werden, damit sich ein Retinoblastom entwickelt. Die Forschungsziele können daher nach gegenwärtigem Kenntnisstand nur unter Nutzung menschlicher Zellen erreicht werden.

Auch durch Nutzung anderer als pluripotenter Stemmzellen des Menschen können die Forschungsziele aller Voraussicht nach nicht erreicht werden. Fötale retinale Stammzellen und fötale retinale Organoide können zwar aus den Retinae von 8 bis 16 Wochen alten abgetriebenen menschlichen Föten gewonnen werden, jedoch stehen sie nicht in der für die Projektdurchführung notwendigen Menge zur Verfügung und können nicht mit der erforderlichen Reproduzierbarkeit bereitgestellt werden. Dies ist jedoch aufgrund der Tatsache, dass Untersuchungen zur Wirksamkeit von Arzneimitteln hochreproduzierbare Testsysteme erfordern, Voraussetzung für eine erfolgreiche Projektdurchführung. Adulte Stammzellen der Retina des Menschen können zwar isoliert und in Kultur genommen werden, jedoch bestehen auch hier Probleme hinsichtlich der Reproduzierbarkeit des jeweils gewonnenen Zellmaterials und der Verfügbarkeit von für die Projektdurchführung erforderlichen Zellmengen. Die Erreichung der Forschungsziele erfordert daher die Verwendung humaner pluripotenter Stammzellen.

Nach derzeitigem Kenntnisstand lassen sich die Forschungsziele auch nicht unter Nutzung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erreichen. In der Literatur wurde vielfach darauf hingewiesen, dass hiPS-Zellen im Gegensatz zu hES-Zellen oft reprogrammierungsbedingte genetische und epigenetische Anomalien aufweisen, die sich auf die Differenzierungsfähigkeit dieser Zellen auswirken können. Dies kann durch die genetischen Hintergründe der Spender, die Eigenschaften der für die Reprogrammierung genutzten somatischen Zellen, die Reprogrammierungsmethode oder die für die Reprogrammierung verwendeten Faktoren begründet sein. Bezüglich des retinalen Differenzierungspotentials von hiPS-Zellen wurde zudem kürzlich gezeigt, dass diese Zellen ein offenbar grundsätzlich nur geringes Potential haben, sich in retinale Organoide zu entwickeln.

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