166. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber

Universitätsklinikum Erlangen

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HUES6 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) ist die Etablierung von humanen Zellmodellen, an dem physiologische Funktionen mikroglialer Zellen und deren Wechselwirkungen mit Neuronen und Oligodendrozyten unter physiologischen und bestimmten pathologischen Bedingungen untersucht werden können. Ziel der Forschungsarbeiten ist es, die Ursachen neurodegenerativer und entzündlicher Prozesse unterschiedlichen Ursprungs besser als bislang zu verstehen. In einem ersten Teilprojekt soll ein Modell für eine genetisch bedingte neurodegenerative Erkrankung des Menschen (die hereditäre diffuse Leukenzephalopathie mit Sphäroiden, HDLS) etabliert werden. Hierfür sollen die für HDLS ursächlichen Mutationen in hES-Zellen erzeugt und die Zellen in Richtung mikroglialer Zellen differenziert werden. In Kokultur mit aus hES-Zellen gewonnenen Oligodendrozyten, Neuronen und/oder neuralen Organoiden sollen dann die Effekte der Mutation(en) auf die Eigenschaften der mikroglialen Zellen sowie auf deren Wechselwirkungen mit den genannten Zelltypen untersucht werden. Durch umfassende Analysen des Transkriptoms, Epigenoms, Proteoms und Sekretoms der Zellen sollen entzündliche Prozesse auf molekularer Ebene näher charakterisiert und ggf. krankheitsrelevante Gene und Signalwege identifiziert werden. In einem zweiten Teilprojekt soll anhand von zwei neuralen Infektionsmodellen die Rolle mikroglialer humaner Zellen bei durch Virusinfektionen ausgelösten entzündlichen Prozessen im ZNS untersucht werden. Hierfür sollen die Kokulturen aus hES-Zell-abgeleiteten Mikrogliazellen und neuralen Zellen/Organoiden mit humanem Immundefizienz-Virus (HIV) bzw. Westnilvirus (WNV) infiziert, die Ursachen der durch die Infektion bedingten entzündlichen Prozesse analysiert und die Effekte von in der klinischen Praxis genutzten anti-retroviral bzw. anti-inflammatorisch wirksamen Substanzen auf zellulärer und molekularer Ebene bestimmt werden. In einem dritten Teilprojekt soll unter Nutzung dieses Zellmodells schließlich die Frage beantwortet werden, welche Rolle aktivierte Mikroglia bei der Pathogenese bestimmter Synucleinopathien spielt, wobei die Parkinson-Erkrankung (PD) und die Multiple Systematrophie (MSA) als Modellkrankheiten dienen. Dabei sollen der Einfluss verschiedener Synuclein-Spezies auf den Grad der Entzündung und auf die Wechselwirkungen von Mikroglia und Neuronen (im Fall von PD) bzw. mit Oligodendrozyten (im Fall von MSA) bestimmt und – u.a. durch Transkriptom-Analysen, Untersuchungen zu Morphologie und Vitalität sowie durch die Bestimmung des inflammatorischen Potentials – die mikrogliale Aktivierung eingehend charakterisiert werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) in erster Linie der Erreichung hochrangiger Forschungsziele in der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Im Rahmen der Forschungsarbeiten sollen – ausgehend von hES-Zellen – Zellmodelle aus neuralen und im ZNS ansässigen myeloiden Zellen etabliert und an diesen Modellen molekulare und zellbiologische Grundlagen von ZNS-Erkrankungen unterschiedlicher Ätiologie untersucht werden, die mit entzündlichen Prozessen einhergehen: genetisch bedingte Neuroinflammation, durch virale Infektionen bedingte Neuroinflammation sowie durch toxische Proteinaggregate verursachte Neuroinflammation.

Im ersten Projektteil sollen zelluläre und molekulare Prozesse untersucht werden, die bei der Pathogenese der HDLS ablaufen, einer seltenen neurodegenerativen Erkrankungen, die teils mit heterozygoten pathologischen Mutationen im CSF1R-Gen assoziiert ist. Die der Erkrankung zugrundeliegenden molekularen und zellulären Veränderungen sind bislang nur unzureichend geklärt. Im Rahmen der Forschungsarbeiten sollen krankheitsassoziierte Mutationen in das CSF1R-Gen in hES-Zellen eingebracht, die modifizierten hES-Zellen zu Mikrogliazellen differenziert und diese gemeinsam mit (ebenfalls aus hES-Zellen abgeleiteten) Oligodendrozyten, Neuronen und/oder ZNS-Organoiden kultiviert werden. Die vergleichende Analyse von mutierten und Wildtyp-Zellen soll Aufschluss über mögliche Veränderungen erbringen, die bei durch Mutationen im CSF1R-Gen bedingter HDLS auftreten, beispielsweise in den Wechselwirkungen zwischen Neuronen/Glia und Mikroglia, in der Vitalität der Zellen, in deren Differenzierungsvermögen sowie in der Aktivierung der Mikroglia. Außerdem sollen Veränderungen im Transkriptom, Epigenom, Proteom und Sekretom bestimmt und so ggf. Signalwege und Prozesse identifiziert werden, deren veränderte Regulation eine Rolle in der Pathogenese der HDLA-Erkrankung spielen. Die Arbeiten können zudem neue Erkenntnisse darüber erbringen, welche Konsequenzen eine veränderte Expression des CSF1R-Gens auf die Entwicklung und Eigenschaften von Mikroglia des Menschen hat.

Im Rahmen eines zweiten Projektteils sollen zelluläre und molekulare Grundlagen von entzündungsbedingten degenerativen Erkrankungen des ZNS untersucht werden, die durch virale Infektionen hervorgerufen werden. HIV kann im menschlichen ZNS das HAND-Syndrom (HIV-associated neurocognitive disorder) verursachen, dessen Entstehung und Pathogenese mit Hilfe des Zellmodells nun untersucht werden soll, beispielsweise durch Analysen der Virusreplikation, der Aktivierung von Mikroglia, der Präsenz neurodegenerationsassoziierter Proteine, des Grades der Neurodegeneration und von Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung und im Transkriptom von Einzelzellen. Dabei sollen auch der Einfluss anti-retroviral wirksamer Substanzen auf molekulare und zelluläre Eigenschaften untersucht und so neue Erkenntnisse über die Grundlagen von deren anti-retroviralen Effekten gewonnen werden. Für die direkte Infektion neuronaler Zellen mit WNV, die sekundär zur Mikroglia-Aktivierung und in der Folge zu inflammatorisch bedingter Neurodegeneration führt, sollen ebenfalls die Mechanismen der Neuro-Inflammation und Neuro-Degeneration bestimmt werden. Zudem soll der Frage nachgegangen werden, wie das angeborene Immunsystem die neurodegenerativen Effekte einer Virusinfektion modulieren kann. Hierfür sollen in An- und Abwesenheit immunsuppressiver Substanzen die virale Replikation, die Aktivierung von Mikroglia, der Grad der Neurodegeneration sowie Veränderungen des Transkriptoms infolge der Virus-Infektion bestimmt werden. Es wird erwartet, dass durch diese Arbeiten neue Erkenntnisse über die Effekte der Mikroglia-Aktivierung auf die Neurodegeneration im Kontext viraler ZNS-Infektionen entstehen und die der Neurodegeneration zugrundliegenden zellulären und molekularen Prozesse besser als bislang verstanden werden können.

Im dritten Vorhabensteil sind Untersuchungen zu den Wechselwirkungen von Mikroglia und neuralen Zellen bei zwei neurodegenerativen Erkrankungen geplant, die mit der Präsenz von α-Synuclein-Aggregaten einhergehen: die Synuclein-vermittelte Neurodegeneration bei der Parkinson-Krankheit (PD) und bei der Multisystematrophie (MSA). Es wird angenommen, dass außer neurotoxischen Effekten der α-Synuclein-Aggregate auch inflammatorische Prozesse unter Beteiligung von Mikrogliazellen eine Rolle bei der Entstehung und Entwicklung dieser Erkrankungen spielen, wobei die hierfür verantwortlichen Mechanismen bislang nur unvollständig verstanden sind. Ziel der genehmigten Arbeiten unter Nutzung des aus hES-Zellen abgeleiteten Modellsystems ist es zunächst, Aufschluss über den Einfluss verschiedener pathologischer Akkumulationszustände von α-Synuclein auf den Grad der Entzündung und auf die damit einhergehende Zelltoxizität zu erlangen. Ferner sollen die genehmigten Forschungsarbeiten dazu beitragen, im Falle der genannten Erkrankungen dysregulierte Signalwege zu identifizieren und die molekularen und zellulären Grundlagen der Entstehung von Synucleinopathien verschiedener Ätiologie zu entschlüsseln. Insbesondere sollen Erkenntnisse darüber gewonnen werden, welche Rolle eine ggf. veränderte Wechselwirkung von Zellen der Mikroglia mit neuralen Zellen des ZNS bei der Pathogenese dieser Erkrankungen spielt.

Die beantragten Arbeiten werden aller Voraussicht nach auch dazu beitragen, ein relevantes humanes neurales Zellmodell für das Immunsystem des Gehirns zu schaffen, an dem auch andere entzündliche und degenerative Prozesse, die unter Beteiligung von Mikroglia bei der Entstehung von Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS) ablaufen, weiter erforscht und an dem künftig neue Pharmaka zur Behandlung entsprechender Erkrankungen bezüglich ihrer möglichen therapeutischen Effekte erprobt und hinsichtlich von Nebenwirkungen überprüft werden können.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Genetische Ursachen für die HDLS sind bekannt; einige Fälle von HDLS werden durch Mutationen im CSF1R-Gen verursacht, wobei das Produkt dieses Gens hinsichtlich seiner grundsätzlichen Funktionen umfassend im Maus-Modell untersucht worden ist. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass das CSF1R-Gen nur in Zellen der myeloiden Linie (im Gehirn Mikroglia und Makrophagen) exprimiert wird und das Genprodukt für das Überleben, die Proliferation und die Differenzierung von myeloiden Zellen erforderlich ist. In der Literatur liegen auch zahlreiche Befunden vor, nach denen virale Infektionen zu entzündlich bedingten neurodegenerativen Prozessen im Gehirn führen können. So deuten beispielweise neuropathologische Befunde aus HIV-Patienten darauf hin, dass eine HIV-assoziierte kognitive Beeinträchtigung am besten mit der verstärkten Präsenz von aktivierten – wenn auch nicht unbedingt infizierten – Mikroglia-Zellen und ZNS-Makrophagen korreliert. Ferner ist aus neuropathologischen Studien bekannt, dass WNV u. a. Neurone in den Basalganglien und in der Substantia Nigra infiziert und dort zu einer Neuroinflammation mit Mikrogliose führt.

Intrazelluläre Proteinaggregate, sogenannte Lewy-Körperchen, sind die auffälligste zelluläre Manifestation der nigrostriatalen Degeneration bei der Parkinson-Krankheit. Hauptbestandteil der Lewy-Körperchen sind pathologische Polymere von α-Synuclein. In zahlreichen Studien mit verschiedenen Zell- und Tiermodellen wurde gezeigt, dass toxische α-Synuclein-Aggregate bei der Pathogenese von Synucleinopathien wie der Parkinson-Krankheit oder MSA eine wesentliche Rolle spielen und in engem Zusammenhang mit neuronaler Dysfunktion und Zelldegeneration stehen. Zudem wurden umfangreiche Studien zu den genauen Mechanismen der Bildung dieser Aggregate durchgeführt und publiziert. In Experimenten mit murinen MSA-Modellen wurde gezeigt, dass α-Synuclein-Aggregate die Reifung der Oligodendrozyten sowie die Myelinbildung beeinflussen. Der Zusammenhang zwischen der Präsenz von α-Synuclein-Aggregaten und dem Auftreten inflammatorischer Prozesse im Gehirn unter Beteiligung von Mikrogliazellen ist in der wissenschaftlichen Literatur gut belegt. So konnte beispielsweise in post mortem-Hirngeweben von Parkinson- und MSA-Patienten reaktive Mikroglia nachgewiesen werden. Zudem weisen Ergebnisse von In-vitro-Versuchen mit aus Nagern isolierten Mikrogliazellen und mit Mikroglia-Zelllinien sowie die Resultate von Experimenten an Maus-Modellen auf eine direkte pro-inflammatorische Wirkung von pathologischen hochmolekularen α-Synuclein-Spezies auf Mikrogliazellen hin.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist es, den Einfluss von Mikroglia auf neuroinflammatorische und neurodegenerative Prozesse in einem Modell für das menschlichen ZNS aufzuklären. Zwar haben Studien an Mausmodellen erheblich zu Kenntnissen über die Funktion von Mikroglia im ZNS beigetragen, jedoch bildet das Mausmodell aufgrund der unterschiedlichen Biologie der Mikroglia in verschiedenen Spezies – beispielsweise in Hinblick auf das Genexpressionsprofil und das Proteom – die humane Situation nur unzureichend ab; Ergebnisse aus Tiermodellen müssen daher in jedem Fall im humanen System überprüft werden, um deren Gültigkeit auch für den Menschen zu bestätigen. Die Forschungsarbeiten erfordern daher den Einsatz menschlicher Zellen.

Die Forschungsziele können nach derzeitigem Kenntnisstand auch nicht unter Nutzung anderer als pluripotenter Stammzellen des Menschen erreicht werden, da primäre humane Mikrogliazellen nach ihrer Inkulturnahme maßgebliche Veränderungen im Transkriptom und Proteom aufweisen. Zudem steht ein solches Material – ebenso wie aus abgetriebenen menschlichen Föten abgeleitete Mikrogliazellen – nicht reproduzierbar und in für die Durchführung des Forschungsvorhabens ausreichender Menge und Qualität zur Verfügung.

Derzeit können die Forschungsziele auch nicht unter Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erreicht werden. Zwar lassen sich auch hiPS-Zellen zu Zellen der Mikroglia differenzieren, jedoch ist in der Literatur derzeit die Frage offen, ob und inwieweit aus hES- und hiPS-Zellen abgeleitete Mikroglia-Zellen tatsächlich identische Eigenschaften haben. Ergebnisse unveröffentlichter Studien legen nahe, dass hiPS-Zellen ein im Vergleich zu hES-Zellen geringeres mikrogliales Differenzierungspotential haben. Zudem sind für die vorgesehene Modellierung von bei Erkrankungen im ZNS auftretenden neuroinflammatorischen und neurodegenerativen Prozessen humane Zellen erforderlich, die einen möglichst ursprünglichen Charakter aufweisen. hiPS-Zellen können – anders als hES-Zellen – bereits aufgrund ihrer Ableitung aus somatischen Zellen ggf. eine Reihe von genetischen Veränderungen aufweisen, die ihren Ursprung im für die Reprogrammierung genutzten somatischen Ausgangsmaterial haben. Darüber hinaus können hiPS-Zellen Mutationen und epigenetische Veränderungen aufweisen, die im Zuge des Reprogrammierungsprozesses und der sich anschließenden klonalen Selektion erworben wurden.

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