148. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC), Berlin

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für Sub-Linien (z.B. für klonale Sub-Linien oder genetisch modifizierte Derivate) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten, die an die mit Bescheid vom 10.08.2017 genehmigten Arbeiten anschließen und diese ergänzen, soll untersucht werden, ob und auf welche Weise das humane endogene Retrovirus H (HERVH) die Chromatinstruktur in embryonalen Stammzellen des Menschen beeinflusst und auf diesem Wege ggf. an der Regulation von deren Pluripotenz beteiligt ist. Hierfür sollen, unter Erzeugung und Nutzung geeigneter Reportergen-Zell-Linien, Subpopulationen von hES-Zellen isoliert und angereichert werden, die die HERVH-Gene stark exprimieren und Merkmale naïver pluripotenter Stammzellen aufweisen (HERVHhigh-hES-Zellen). Diese sollen dann, im Vergleich mit hES-Zellen mit geringer bzw. durchschnittlicher HERVH-Aktivität, eingehend bezüglich ihres Transkriptoms und ihrer Chromatinstruktur analysiert werden. Dabei sollen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen DNA-Domänen bestimmt, genomweite Chromatin-Kontaktkarten erstellt und regulatorische Elemente der Chromatinstruktur identifiziert werden. Weiterhin soll der Einfluss von Histonmodifikationen in HERVH-haltigen Genom-Regionen auf die Pluripotenz-Regulation in hES-Zellen mit hoher und geringer HERVH-Aktivität untersucht werden. Dazu soll ein System genutzt werden, mit dem spezifische Lysin-Methylierungen entfernt und deren Einfluss auf die entsprechenden Eigenschaften von hES-Zellen bestimmt werden können. Ferner soll der Einfluss der HERVH-Aktivität auf die Formierung bzw. Stabilisierung sogenannter topologisch assoziierender Domänen (TAD) des Chromatins ermittelt werden. Hierfür sollen HERVH-Elemente, die sich an den Grenzen von TAD befinden, identifiziert und anschließend überprüft werden, ob durch den gezielten knock out der entsprechenden HERVH-Elemente die Bildung neuer bzw. die Stabilität vorhandener TAD verändert werden kann. Schließlich soll überprüft werden, ob und inwieweit HERVH in HERVHhigh-hES-Zellen auch als distale Enhancer fungieren.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen dienen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) der Erreichung hochrangiger Forschungsziele im Rahmen der Grundlagenforschung.

Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist die Beantwortung der Frage, ob und inwieweit die vermutete Regulation der Pluripotenz menschlicher Zellen durch HERVH mit spezifischen Chromatin-Konformationen assoziiert ist, ob veränderte Methylierung von HERVH mit Konformationsänderungen des Chromatins einhergeht, ob HERVH die Stabilität oder Entstehung topologisch assoziierender Domänen (TAD) beeinflusst und ob HERVH in hES-Zellen als distaler Enhancer wirkt.

Zunächst soll dafür eine vergleichende Analyse des Transkriptoms sowie der Chromatin-Konformation und -Organisation in Zellen mit hoher und durchschnittlicher HERVH-Aktivität durchgeführt werden. Dazu sollen die Transkriptome verglichen, genomweite Chromatin-Kontaktkarten erstellt und die Präsenz von offenem Chromatin und regulatorischen Elementen im Genom untersucht werden. Ferner sollen Chromatin-Bindungsstellen von wesentlichen Regulatoren der Genexpression ermittelt werden. Die Arbeiten sollen Hinweise auf einen vermuteten Zusammenhang zwischen einer starken Aktivität von HERVH, einem durch die erhöhte HERVH-Aktivität bedingten spezifischen Transkriptom und einer ggf. veränderten Chromatinstruktur erbringen.

Im weiteren soll der Einfluss von Histonmodifikationen auf die HERVH-vermittelte Pluripotenzregulation näher untersucht werden. Es ist bekannt, dass bivalente Domänen, die Methylierungen in H3K4 und H3K27 aufweisen, bei der Regulation von Pluripotenz und Differenzierung eine erhebliche Rolle spielen. Gleichzeitig sind auch Transposons mit entsprechenden Methylierungsmustern assoziiert, so dass angenommen wird, dass die vermutete HERVH-vermittelte Regulation der Pluripotenz ggf. auch durch eine Modulation der DNA-Methylierung bedingt wird. Daher sollen spezifische Lysin-Methylierungen von HERVH in HERVHhigh- und genetisch unveränderten Vergleichszellen gezielt entfernt und die Konsequenzen für die Genexpression und die Chromatinstruktur untersucht werden. Dadurch soll geklärt werden, ob und inwieweit spezifische Veränderungen in den Histonmarkierungen, in Abhängigkeit von einer unterschiedlich hohen HERVH-Aktivität, die dreidimensionale Chromatinstruktur und die Genexpression beeinflussen.

Im folgenden soll die Rolle von HERVH für die Etablierung, die Stabilisierung oder den Abbau von TAD untersucht werden. Auf Grundlage der zuvor gewonnenen Chromatin-Kontaktkarten aus HERVHhigh- und genetisch unveränderten hES-Zellen sollen TAD identifiziert bzw. neue Erkenntnisse darüber gewonnen werden, ob infolge einer verstärkten HERVH-Aktivität bestehende TAD stabilisiert oder abgebaut bzw. neue TAD etabliert werden. Dies lässt Rückschlüsse darauf zu, ob und inwieweit die HERV-Aktivität mit einer Umstrukturierung des Chromatins in hES-Zellen als Grundlage für eine veränderte Genaktivität in Zusammenhang steht. Durch Vergleich der dabei gewonnenen Daten mit Daten, die in parallel durchgeführten Forschungsvorhaben unter Nutzung embryonaler Stammzellen aus Primaten zur selben Frage erhoben werden, sollen zudem Hinweise darauf gewonnen werden, ob und inwieweit die durch die Aktivität endogener Retroviren bedingten Veränderungen in den TAD und in der Chromatinstruktur humanspezifisch sind. Zudem sollen ausgewählte HERVH-Loci, die an potentiellen TAD-Grenzen liegen, funktional ausgeschaltet werden und der Effekt auf das Transkriptom der Zellen und auf die dreidimensionale Struktur des Genoms bestimmt werden. Auf diesem Wege soll die mögliche Rolle spezifischer HERVH-Loci auf die Etablierung/Stabilität von TAD bestimmt und somit deren Bedeutung für die Ausbildung einer für hohe HERVH-Aktivität typischen Chromatinstruktur ermittelt werden. Dies soll zu neuen Erkenntnissen über den Einfluss von HERVH-abhängigen TAD auf die Chromatinstruktur in hES-Zellen und auf regulatorische Netzwerke beitragen, die für die Etablierung bzw. Erhaltung der Pluripotenz erforderlich sind.

Schließlich soll untersucht werden, ob HERVH in hES-Zellen auch als distaler Enhancer fungiert und ob diese Funktion mit der Etablierung/Stabilisierung von TAD in Zusammenhang steht. Dazu sollen potentielle Enhancer-Sequenzen in bestimmten HERVH-Loci an TAD-Grenzen deletiert und die Auswirkungen auf das Transkriptom analysiert werden. Diese Arbeiten können ggf. Aufschluss darüber ergeben, ob und auf welche Weise weitere Moleküle und Signalwege, die für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz von hES-Zellen bedeutsam sind, durch HERVH reguliert werden. Ggf. können hier auch Gene identifiziert werden, deren Produkte insbesondere bei einer starken, mit naïver Pluripotenz korrelierten Aktivität von HERVH für die Etablierung und Aufrechterhaltung von Pluripotenz in hES-Zellen erforderlich sind.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten hinreichend vorgeklärt ist.

Die Regulation der frühen menschlichen Embryonalentwicklung, der Pluripotenz menschlicher Zellen sowie von Differenzierungsvorgängen durch in das Genom integrierte retrovirale Elemente ist in der Literatur gut belegt, wobei auch eine Beteiligung von HERVH an der Pluripotenz-Regulation in humanen Stammzellen nachgewiesen wurde. Zudem liegen Daten vor, wonach in hES-Zellen, die Merkmale naïver Stammzellen aufweisen, die HERVH-Gene stark exprimiert werden, was mit einer erhöhten Aktivität der LTR7 verbunden ist. Die starke Aktivität der LTR7 ist Grundlage für die im Vorhaben geplante Anreicherung von hES-Zellen mit starker HERVH-Aktivität. Die Tatsache, dass HERVH im Genom menschlicher embryonaler Stammzellen spezifische Chromatin-Markierungen aufweist, ist ebenfalls bekannt. So wurde eine starke Assoziation von HERVH und H3K4 beobachtet, die im Zuge Differenzierung der ES-Zellen verlorengeht und die in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen deutlich geringer ausgeprägt war als in hES-Zellen. Die Inaktivierung endogener Retroviren durch Trimethylierung von H3K9 ist für murine embryonale Stammzellen gut belegt. Auch das Konzept der Organisation des Genoms in strukturierten Domänen, die miteinander wechselwirken, ist in der Literatur etabliert und wurde u. a. unter Nutzung von embryonalen Stammzellen der Maus und des Menschen erarbeitet. Topologisch assoziierende Domänen (TAD) wurden unter Verwendung neuer Technologien zur Analyse der Konformation von Chromatin, die auch im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten zum Einsatz kommen sollen, identifiziert und bezeichnen große DNA-Abschnitte (im Megabasen-Bereich), die ein bestimmendes Strukturmerkmal der DNA in eukaryotischen Zellen sind und eine starke Konservierung aufweisen. Die Tatsache, dass strukturelle Variationen die TAD-Konfiguration beeinträchtigen und somit zu einer veränderten Genexpression führen, ist in der Literatur belegt. Zudem kommt es beim Übergang vom naïven in das geprägte Stadium der hES-Zell-Entwicklung zu Veränderungen der Grenzen der TAD. Die zur Durchführung der Forschungsarbeiten geplanten methodischen Vorgehensweisen für die genetischen Veränderungen von hES-Zellen sowie zur Analyse der Genexpression und Chromatinstruktur sind in der wissenschaftlichen Literatur vielfach beschrieben worden und gut etabliert.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Ziel der beantragten Forschungsarbeiten ist es, die durch HERVH vermittelte Regulation der Pluripotenz in menschlichen Zellen besser als bislang zu verstehen. Dieses Forschungsziel erfordert aus wenigstens zwei Gründen die Verwendung menschlicher Zellen. Zum einen unterscheiden sich die Mechanismen, die bei der Etablierung und Aufrechterhaltung der Pluripotenz in Zellen verschiedener Spezies eine Rolle spielen, teils erheblich, so dass teils verschiedene regulatorische Netzwerke in die Etablierung und Bewahrung des undifferenzierten Zustandes pluripotenter Zellen verschiedener Spezies involviert sind. Zum anderen ist HERVH erst relativ spät (nach der Separierung der Neu- von den Altweltaffen) in das Genom gelangt und ist daher nur im Menschen und einigen Altweltaffen präsent. Das Forschungsziel, die molekularen Grundlagen der HERVH-vermittelten Pluripotenz-Regulation beim Menschen zu entschlüsseln, erfordert daher die Nutzung humanen Materials.

Die Forschungsziele können auch nicht unter Nutzung anderer als humaner pluripotenter (Stamm)Zellen erreicht werden, da grundlegende Fragen zur Pluripotenz nur an pluripotenten Stammzellen, nicht aber an Zellen untersucht werden können, die das Stadium der Pluripotenz bereits durchlaufen haben (wie beispielsweise adulte und fötale Stammzellen, primäre Zellen etc.).

Nach derzeitigem Kenntnisstand können die Forschungsziele auch nicht unter Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erreicht werden. Untersuchungen zu (epigenetischen) Prozessen der Pluripotenz-Regulation im Menschen erfordern Zellen, die sehr ursprünglich sind und der natürlichen Situation möglichst nahekommen. In der Literatur wurde jedoch vielfach darauf hingewiesen, dass hiPS-Zellen oft reprogrammierungsbedingte epigenetische Unterschiede zu hES-Zellen aufweisen. Das Genom von hiPS-Zellen kann ferner sowohl reprogrammierungsbedingte Veränderungen als auch Mutationen aufweisen, die bereits in der somatischen Zelle vorhanden sind, aus der sie abgeleitet wurden. Es ist nicht geklärt, wie diese epigenetischen und genetischen Veränderungen die mit Pluripotenz zusammenhängenden Eigenschaften und deren molekulare Grundlagen beeinflussen. Zudem bestehen Unterschiede zwischen hES- und hiPS-Zellen in der Methylierung von H3K4 in den im Genom befindlichen endogenen Retroviren.

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