146. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Technische Universität Dresden

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für Sub-Linien (z.B. für klonale Sub-Linien oder genetisch modifizierte Derivate) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien..

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der beantragten Forschungsarbeiten ist die Herstellung von Zellen der Nebennierenrinde bzw. von Nebennieren-ähnlichen Organoiden, die in der Lage sind, Steroidhormone zu produzieren. Dazu sollen hES-Zellen zunächst nach bereits publizierten Protokollen in intermediäres Mesoderm differenziert und anschließend neue Vorgehensweisen für deren weitere Differenzierung in steroidproduzierende Zellen entwickelt werden. Hierfür soll insbesondere eine Reporterzell-hES-Zell-Linie erzeugt werden, in der die Expression eines Reportergens an die Expression des Gens für den steroidogenen Faktor 1 (SF-1) gekoppelt ist. Mittels dieser Reporterzell-Linie sollen kleine Moleküle identifiziert werden, die die Entwicklung von Zellen des intermediären Mesoderms in Nebennierenrindenzellen anstoßen oder fördern und auf dieser Grundlage ein effizientes Differenzierungsprotokoll entwickelt werden. Die steroidproduzierenden Zellen/Organoide sollen dann umfassend hinsichtlich biochemischer, molekularbiologischer und funktionaler Parameter in vitro charakterisiert und anschließend in Mausmodelle der Nebenniereninsuffizienz transplantiert werden. Dabei soll insbesondere überprüft werden, ob und inwieweit die Zellen sich in das Wirtsgewebe integrieren und dort funktional aktiv sind, also menschliche Steroide erzeugen und die Nebenniereninsuffizienz kompensieren können. Zudem sollen aus hES-Zellen abgeleitete Nebennierenrindenzellen zur Etablierung eines Zell-/Organoid-Modells für genetisch bedingte Nebenniereninsuffizienz genutzt werden. Hierfür sollen in hES-Zellen Mutationen in Genen erzeugt werden, die für steroidogene Enzyme codieren, und überprüft werden, ob und inwieweit die Differenzierung dieser Zellen in Nebennierenrindenzellen bzw. deren Phänotyp verändert/beeinträchtigt ist.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen dienen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) der Erreichung hochrangiger Forschungsziele im Rahmen der Grundlagenforschung, können mittelfristig aber auch einen Beitrag zur Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren zur Anwendung bei Menschen erbringen.

Langfristiges Ziel des Forschungsvorhabens ist es, auf pluripotenten Stammzellen des Menschen basierende Zellersatztherapien für Patienten mit Nebennieren(rinden)-Insuffizienz zu entwickeln. Gegenwärtig werden betroffene Patienten durch Hormonsubstitution behandelt; diese lebenslang erforderliche Therapie kann die Symptome jedoch nur teilweise lindern und kann darüber hinaus mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden sein. Voraussetzung für die langfristige Verfügbarmachung entsprechender Ersatztherapien ist jedoch die Bereitstellung funktional aktiver Transplantate, was wiederum die Verfügbarkeit effizienter Differenzierungsprotokolle und – als Grundlage für diese – ein fundiertes Verständnis der entsprechenden Entwicklungsvorgänge beim Menschen voraussetzt.

Das zentrale Ziel der genehmigten Arbeiten besteht darin, effiziente und sichere Vorgehensweisen für die Herstellung steroidproduzierender Nebennieren(rinden)-Zellen und -Organoide zu entwickeln. Dies soll auf Grundlage einer hES-Zell-basierten Reporter-Zelllinie erfolgen, durch deren Nutzung der Fortgang der steroidogenen Differenzierung sichtbar gemacht werden kann. Mit Hilfe dieses Reporter-Systems sollen kleine Moleküle identifiziert werden, die die Entwicklung von intermediärem Mesoderm in Richtung von Zellen der Nebennierenrinde anstoßen, fördern oder auf andere Weise modulieren. Dies wird aller Voraussicht nach zur Identifizierung von Signalwegen führen, die beim Menschen in die Entstehung von Nebennierenzellen involviert sind, was wiederum Grundlage für die Optimierung bestehender oder die Entwicklung neuer Protokolle zur In-vitro-Gewinnung von humanen Nebennierenzellen sein kann. Wesentlich ist dabei, dass – anders als bei den bislang beschriebenen Vorgehensweisen – auf eine ektopische (Über)Expression von Transkriptionsfaktorgenen verzichtet werden kann, was auch die Sicherheit der gewonnenen Zellen (beispielsweise in Hinblick auf eine unerwünschte Restexpression der ektopischen Transkriptionsfaktor-Gene nach Abschluß der Differenzierung) erhöht und von erheblichem Vorteil für eine spätere klinische Verwendung wäre. Zudem können auf diesem Wege voraussichtlich Erkenntnisse über Entwicklungsvorgänge gewonnen werden, die im frühen menschlichen Embryo bei der Segregation und weiteren Entwicklung des intermediären Mesoderms ablaufen, was von entwicklungsbiologischer Relevanz ist.

Zudem soll untersucht werden, inwieweit aus hES-Zellen gewonnene Nebennieren(rinden)-Zellen und -Organoide in Versuchstiere transplantiert werden können und dort ein therapeutisches Potential haben. Dabei geht es zum einen darum, die Integration, Vitalität und Funktionalität der Zellen bzw. Organoide nach Transplantation unter die Nierenkapsel oder nach intraadrenaler Transplantation zu analysieren. Zum anderen soll in Versuchstieren, bei denen eine experimentelle Nebenniereninsuffizienz induziert wurde, überprüft werden, ob die Transplantate in der Lage sind, den Verlust der endogenen Steroidproduktion zu kompensieren. Dies wird Aussagen darüber ermöglichen, ob und inwieweit stammzellabgeleitete Zellen/Organoide hinsichtlich der Steroidproduktion funktional sind und ob die weitere Entwicklung dieses therapeutischen Ansatzes für die Behandlung der Nebenniereninsuffizienz erfolgversprechend ist. Dies ist von erheblicher medizinischer Relevanz.

Ferner sollen Erkenntnisse darüber gewonnen werden, auf welchem Wege Mutationen in Genen, die für steroidogene Enzyme/Faktoren codieren und die bei kongenitaler Nebennieren-Hyperplasie (CAH) mutiert sind, die Entwicklung und Eigenschaften von steroidproduzierenden Zellen/Organoiden beeinträchtigen. Dafür sollen patientenspezifische Mutationen in hES-Zellen erzeugt, diese unter Nutzung der im ersten Projektteil etablierten Vorgehensweisen in Richtung steroidproduzierender Zellen/Organoide differenziert und überprüft werden, ob und in welchem Umfang die Entwicklung und der Phänotyp der steroidproduzierenden Zellen beeinträchtigt ist. Auf diesem Wege sollen vor allem Kenntnisse über zellbiologische und molekulare Veränderungen infolge der jeweiligen genetischen Veränderung gewonnen werden, was zu einem besseren Verständnis von den molekularen und zellulären Pathogenesemechanismen der angeborenen Nebennieren-Hyperplasie beitragen kann.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten hinreichend vorgeklärt ist.

Die zu klärende Forschungsfrage besteht vornehmlich in der Entwicklung bzw. Optimierung von Vorgehensweisen für die Gewinnung steroidproduzierender Zellen aus hES-Zellen, die in vitro und in vivo funktional sind. Ferner sollen zellbasierte Krankheitsmodelle für genetisch bedingte Formen der Nebennieren-Hyperplasie etabliert werden. In der wissenschaftlichen Literatur liegen bereits grundlegende Arbeiten zur Differenzierung von murinen Zellen in Nebennieren(rinden)-Zellen mit steroidogenen Eigenschaften vor. Methoden für die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen des Menschen in Zellen des intermediären Mesoderms sind bereits seit mehreren Jahren verfügbar. Die Differenzierung humaner mesodermaler Zellen, in Richtung steroidproduzierender Nebennieren(rinden)-Zellen wurde gleichfalls bereits in der Literatur beschrieben, wobei hier allerdings die ektopische Expression des Gens für SF1 Voraussetzung für den Differenzierungserfolg war. Die im Vorhaben zu entwickelnden Differenzierungsstrategien bauen folglich auf Vorarbeiten auf, die nicht nur in murinen, sondern bereits auch in humanen pluripotenten Stammzellen durchgeführt wurden.

Die zentrale Rolle von SF1 für die Entwicklung steroidproduzierender Zellen wurde – beispielsweise unter Nutzung embryonaler Stammzellen der Maus – bereits gezeigt. Die grundlegende Rolle von SF1 für die steroidogene Differenzierung auch von Zellen anderer Provenienz ist ebenfalls umfangreich belegt. In der Gruppe des für die Forschung verantwortlichen Forschers wurden beispielsweise Methoden zur Erzeugung steroidogener Zellen durch direkte Transprogrammierung somatischer Zellen von Patienten mit Nebenniereninsuffizienz entwickelt; die Vorgehensweise beruhte ebenfalls auf der ektopischen Überexpression des Gens für SF1. Auch die genetischen Grundlagen für die hier interessierende Erkrankung, die angeborene Nebennieren-Hyperplasie (CAH), sind gut bekannt; beispielsweise ist die Assoziation der hier in hES-Zellen zu etablierenden Punktmutationen im CYP21A2-Gen mit einer deutlich verringerten Enzymaktivität und mit der Entstehung von CAH gut belegt.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Nutzung menschlicher Zellen ist für die Erreichung der Forschungsziele aus wenigstens zwei Gründen erforderlich. Zum einen besteht das langfristige Ziel des Vorhabens in der Schaffung von Voraussetzungen für die Etablierung einer Gewebeersatztherapie für die Behandlung von Nebenniereninsuffizienz beim Menschen, was die Nutzung humaner Zellen erfordert. Zum anderen sollen Fragen nach Molekülen und Signalwegen geklärt werden, die bei der Entstehung insbesondere des (steroidproduzierenden) adrenalen Kortex eine Rolle spielen. Auch dies erfordert menschliche Zellen, da erhebliche speziesspezifische Unterschiede in der Struktur und Enzymausstattung der Nebennierenrinde bestehen. Während die Nebennierenrinde beim Menschen aus drei Schichten besteht, weist beispielsweise die Nebennierenrinde bei Mäusen lediglich zwei Zonen auf. Zudem produziert der adrenale Kortex der Maus kein Kortisol, da die Maus Kortikosteron als Glukokortikoid verwendet. Entsprechend bestehen Unterschiede in der Enzymausstattung, Mäuse verfügen beispielsweise nicht über CYP17A1, das für die Kortisol-Produktion essentiell ist. Weiteres Ziel des Forschungsvorhabens ist die Etablierung von Vorgehensweisen für die Umwandlung von intermediärem Mesoderm in steroidproduzierende Zellen durch kleine Moleküle, wobei die zugrundeliegenden molekularen Vorgänge sowie die beteiligten Moleküle/Signalwege besser als bislang verstanden werden sollen. Intermediäres Mesoderm tritt jedoch nur in sehr frühen Phasen der Embryonalentwicklung auf und ist beim Menschen aus anderen Quellen als pluripotenten Stammzellen nicht zugänglich. Andere als pluripotente humane Zelltypen (fötale und adulte Stammzellen, primäre somatische Zellen) haben das hier relevante Entwicklungsstadium aber bereits durchschritten und können daher nicht zur Erreichung der Forschungsziele verwendet werden.

Die Forschungsziele können aller Voraussicht nach auch nicht unter Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erreicht werden. Zum einen soll die Entwicklung der Nebenniere in vitro „nachgestellt“ werden; dies erfordert ein möglichst ursprüngliches Zellmaterial, das frei von potentiellen reprogrammierungsbedingten Veränderungen des Epigenoms ist, wie sie für hiPS-Zellen berichtet wurden. Zudem sollen Effekte von spezifischen Mutationen in Genen untersucht werden, deren Aktivitätsminderung zu Nebenniereninsuffizienz führt. Hierfür sind ebenfalls Zellen erforderlich, die einen möglichst ursprünglichen Charakter aufweisen und frei von somatischen Mutationen sind, die im für die Reprogrammierung genutzten Ausgangsmaterial bereits vorhanden sind oder während des Reprogrammierungsprozesses erworben wurden. Diese Voraussetzung erfüllen hiPS-Zellen nicht. Zudem stellt die bei hiPS-Zellen oft zu beobachtende hohe Variabilität im Differenzierungspotential ein erhebliches Problem bei der Nutzung dieser Zellen für die Entwicklung von Differenzierungsprotokollen dar.

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