145. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber

Frau Professor Dr. Michaela Frye, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Heidelberg

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HUES6 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für Sub-Linien (z.B. für klonale Sub-Linien oder genetisch modifizierte Derivate) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) ist die Untersuchung der Rolle von RNA-Modifikationen, insbesondere tRNA-Modifikationen, für die Aufrechterhaltung von Pluripotenz und für die (neuro-)ektodermale Differenzierung. Hintergrund der Forschungsarbeiten ist die Tatsache, dass Mutationen in Genen, die für RNA-modifizierende Enzyme codieren, teilweise mit schweren neurologischen Erkrankungen und Entwicklungsstörungen assoziiert sind. Daher soll in hES-Zellen eine Reihe derartiger Gene nunmehr so modifiziert werden, dass deren Expression entweder vermindert oder ausgeschaltet, ggf. aber auch verstärkt ist. Anschließend soll der Effekt der genetischen Veränderungen auf das Ausmaß der tRNA-Modifikation in hES-Zellen bestimmt und ein möglicher Einfluss auf die Fähigkeit der Zellen zur Selbsterneuerung und frühen Differenzierung, insbesondere in ektodermale Zellen, analysiert werden. Danach sollen genetisch modifizierte und unveränderte hES-Zellen hinsichtlich ihrer Fähigkeit verglichen werden, in neuronale Zellen bzw. neuronale Organoide zu differenzieren, und es soll überprüft werden, ob und inwieweit sich die jeweils gewonnenen Neurone bzw. neuronalen Organoide bezüglich ihrer phänotypischen, molekularen und funktionalen Eigenschaften unterscheiden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen dienen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) der Erreichung hochrangiger Forschungsziele im Rahmen der Grundlagenforschung.

Für die essentielle Bedeutung von (posttranskriptionalen) tRNA-Modifikationen für die Gehirnentwicklung liegen aus der Literatur zahlreiche Hinweise vor. So sind beispielsweise Mutationen in Genen, deren Produkte an der enzymatischen Modifikation von tRNAs beteiligt sind, mit zum Teil schwerwiegenden neurologischen Erkrankungen und Entwicklungsstörungen assoziiert. Ein funktionaler knock out des NSUN2-Gens führt beispielsweise zu autosomal-rezessiver mentaler Retardierung Typ 5 (MRT5). Das Genprodukt des NSUN2-Gens, dessen vier unterschiedliche Transkripte während verschiedener Entwicklungsphasen im menschlichen Gehirn präsent sind, katalysiert u. a. die Methylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin in Position 34 des tRNA(Leu)(CAA)-Vorläufers und in den Positionen 47 und 48 des tRNA-(Asp)(GTC)-Vorläufers. Im knock out-Mausmodell führt der Verlust der Cytosin-Methylierung zu einer Akkumulation kleiner tRNA-Fragmente in der Zelle, was wiederum mit einer verringerten Translationsrate und der Aktivierung von Stressreaktionen verbunden ist, die zu einer verringerten Zellgröße und verstärkter Apoptose von kortikalen,  hippocampalen und striatalen Neuronen führt.

Obwohl die Assoziation von genetischen Defekten mit Intelligenzminderung und Fehlentwicklungen des Zentralnervensystems durch zahlreiche Studien belegt ist, ist die Frage danach, welche Rolle spezifische Modifikationen der tRNA insbesondere für die neuronale Entwicklung spielen, bislang weitgehend ungeklärt. Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten soll daher in einem Zellmodell für neuronale Differenzierung und Entwicklung vor allem untersucht werden, welche molekularen und zellbiologischen Effekte der funktionale knock out von Genen hat, die für verschiedene tRNA-modifizierende Enzyme codieren.

Dafür sollen zunächst verschiedene Gene, die für tRNA modifizierende Enzyme codieren, in hES-Zellen funktional ausgeschaltet und die dadurch bewirkten Veränderungen in der Modifikation von tRNAs qualitativ und quantitativ erfasst werden. Hierdurch soll bereits der (nicht in jedem Fall belegte) Zusammenhang zwischen der entsprechenden genetischen Veränderung und den (ggf. bislang nur postulierten) Veränderungen im Pool der jeweils spezifisch modifizierten zellulären tRNAs nachgewiesen werden. Gleichzeitig soll der Effekt dieser genetischen Veränderungen auf die Pluripotenz humaner ES-Zellen überprüft werden, woraus sich neue Erkenntnisse über die Rolle von tRNA-modifizierenden Enzymen für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz menschlicher Zellen ergeben können.

Die neuronale In-vitro-Differenzierung der genetisch veränderten hES-Zellen und die umfassende Charakterisierung der differenzierten Derivate in verschiedenen Stadien ihrer Entwicklung soll Aufschluss darüber erbringen, ob und inwieweit eine (durch spezifische Enzymdefekte bedingte) Veränderung in der Modifikation von tRNAs bestimmte Prozesse der neuronalen Differenzierung beeinträchtigt, in welchem Stadium der Entwicklung neuraler Zellen die Störungen ggf. auftreten und welche Eigenschaften der (genetisch veränderten) Neurone infolge der genetischen Modifikation verändert sind. Auf diesem Wege könnten auch molekulare und zellbiologische Prozesse identifiziert werden, die an der Pathogenese der mit der jeweiligen genetischen Veränderung assoziierten Erkrankungen/Entwicklungsstörungen beteiligt sind, wodurch zu einem besseren Verständnis der molekularen Ätiologie dieser Krankheiten beigetragen werden könnte.

Über die Untersuchung der Effekte von Mutationen in Genen für tRNA-modifizierende Enzyme hinaus soll auf dieselbe Weise auch untersucht werden, welche Effekte Mutationen in Genen, deren Produkte Bestandteile des sog. Elongator-Komplexes sind, auf die Entwicklung/Eigenschaften menschlicher pluripotenter Stammzellen und Neurone haben. In diesem Zusammenhang sollen beispielsweise Mutationen in den Genen für IKBKAP und ELP4 erzeugt werden; ein funktionaler knock out ist hier mit Dysautonomie und Epilepsie assoziiert. Auch diese Arbeiten lassen Erkenntnisse darüber erwarten, welche spezifischen Prozesse der neuralen/neuronalen Differenzierung durch genetische Defekte in bestimmten Genen beeinträchtigt sind, ob und wenn ja welche Eigenschaften der betreffenden Neurone verändert sind und auf welchem Wege die jeweilige Mutation zur Genese von neuronalen Erkrankungen beitragen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten hinreichend vorgeklärt ist.

Geklärt werden soll die Frage nach spezifischen Funktionen von tRNA-modifizierenden Enzymen für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz menschlicher pluripotenter Stammzellen und für die ektodermale und insbesondere neuronale Differenzierung pluripotenter Stammzellen. Die Präsenz chemischer Modifikation an tRNA und deren Rolle für die tRNA-Funktion sind seit langem bekannt; die für die Etablierung der Modifikationen zuständigen Enzyme wurden identifiziert und charakterisiert. In der wissenschaftlichen Literatur liegen zudem Belege dafür vor, dass die Aktivität tRNA-modifizierender Enzyme für die Pluripotenz pluripotenter Stammzellen der Maus essentiell ist. So führte der knock out des Nsun3-Gens in murinen ES-Zellen zu einer verminderten Zellproliferation sowie zu einer starken Tendenz zur Differenzierung in meso- und entodermale Zellen auf Kosten der Differenzierung in Zellen der ektodermalen Linie. Dies weist auf eine wesentliche Funktion des  Nsun3--Genproduktes für die ektodermale Differenzierung in murinen Zellen hin, was im Rahmen der beantragten Arbeiten nunmehr auch für menschliche Zellen untersucht werden soll. Mutationen in den Genen, die für den N7-Methylguanosine-Methyltransferase-Komplex METTL1/WDR4 codieren, führten zu verringerter Zellproliferation von murinen ES-Zellen und verminderten deren Fähigkeit, sich in neuronale Zellen zu differenzieren. Die Rolle weiterer hier interessierender Gene für die neurale Entwicklung der Maus ist ebenfalls bekannt. So führt der knock out des Maus-Orthologen für TRM1, das für eine N2,N2-Dimethylguanosin-tRNA-Methyltransferase codiert und prä- und postnatal in verschiedenen Hirnregionen der Maus exprimiert wird, zu motorischen und Verhaltensstörungen. Die Tatsache, dass Mutationen in Genen für tRNA-modifizierende Enzyme mit neurologischen Erkrankungen sowie mit Entwicklungsstörungen beim Menschen assoziiert sind, ist belegt. So konnte bei Patienten mit Dubowitz-Syndrom gezeigt werden, dass eine splicing-Mutation im NSUN2-Gen Ursache der Erkrankung ist. Eine Mutation im ADAT3-Gen, das für eine Untereinheit einer tRNA-spezifischen Adenosin-Desaminase codiert, ist wiederum mit mentaler Retardierung beim Menschen assoziiert. Auch in hES-Zellen wurden bereits Studien zur Rolle von tRNA Modifikationen durchgeführt. Durch Verwendung von hES-Zellen, in denen das Pseudouridin-Synthase-7-Gen funktional ausgeschaltet worden war, konnte gezeigt werden, das die Feinabstimmung der Translationsinitiation nicht länger gewährleistet und damit u. a. das Stammzellwachstum und die Differenzierung dereguliert waren. Die geplanten Vorgehensweisen zur Differenzierung von hES-Zellen in die ektodermale bzw. neuronale Linie, zur genetischen Veränderung von hES-Zellen sowie zur Analyse des Transkriptoms, des Ausmaßes von RNA-Modifikationen, der Translationsrate sowie der Identität und Funktion der differenzierten Zellen sind gut etabliert.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die beantragten Forschungsarbeiten zielen auf die Aufklärung der Bedeutung von tRNA Modifikationen in der frühen Entwicklung des Gehirns beim Menschen. Grundsätzliche Fragen zur Aufklärung der Rolle von tRNA Modifikationen konnten in tierischen Zellen oder im Tiermodell geklärt werden, insbesondere in transgenen Mausmodellen. Aufgrund speziesspezifischer Unterschiede in der Gehirnentwicklung können in Tieren gewonnene Erkenntnisse jedoch nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragen werden. Zudem bestehen speziesspezifische Unterschiede in der Aktivität und Spezifität bestimmter RNA-modifizierender Enzyme. So modifiziert NSUN2 beispielsweise verschiedene vault-RNAs in humanen Zellen, nicht jedoch in Zellen der Maus. Zur Aufklärung der Rolle tRNA-modifizierender Enzyme für die Entwicklung des Menschen (und insbesondere des menschlichen Gehirns) sind folglich menschliche Zellen erforderlich.

Die Forschungsziele können ferner voraussichtlich nur unter Nutzung humaner pluripotenter Stammzellen erreicht werden, da hier auch Prozesse untersucht werden sollen, die mutmaßlich in frühen Stadien der menschlichen Entwicklung ablaufen. Nicht-pluripotente Zellen des Menschen haben die hier relevanten (frühembryonalen) Entwicklungsstadien aber bereits durchschritten, weisen nicht das erforderliche Differenzierungsvermögen auf und/oder sind den erforderlichen genetischen Veränderungen nicht zugänglich.

Nach derzeitigem Kenntnisstand können die Forschungsziele voraussichtlich auch nicht unter Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erreicht werden. In der Literatur wurde vielfach darauf hingewiesen, dass hiPS-Zellen ggf. reprogrammierungsbedingte Besonderheiten im Epigenom aufweisen, die sie von hES-Zellen unterscheiden. Angesichts der Tatsache, dass im Projekt Prozesse auf der Ebene der epigenetischen Regulation untersucht werden sollen, ist jedoch ein möglichst authentisches Epigenom der genutzten Zellen für die Erreichung der Forschungsziele von essentieller Bedeutung.

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