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136. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

Erteilt am 05.07.2018.

1. Genehmigungsinhaber(in)

Universitätsklinikum Essen

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

  • H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
  • H7 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
  • H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
  • HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
  • HES-4 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
  • I3 (Technion - Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
  • I4 (Technion - Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
  • I6 (Technion - Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
  • KhES-1 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan)
  • KhES-2 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan)
  • KhES-3 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan

Die Genehmigung gilt auch für die Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Das Forschungsvorhaben ist Teil einer Gruppe von Projekten am Universitätsklinikum Essen, in denen molekulare Ursachen von syndromalen Erkrankungen des Menschen aufgeklärt werden sollen, die mit Intelligenzminderung einhergehen.

Im Rahmen der hier genehmigten Forschungsarbeiten sollen molekulare und entwicklungsbiologische Aspekte von Erkrankungen untersucht werden, deren Ursache in einem veränderten Nukleosomenprofil liegen könnte. Als Modelle hierfür sollen das Coffin-Siris-Syndrom und das Nicolaides-Baraitser-Syndrom dienen. Beide Syndrome sind mit Mutationen in Genen assoziiert, die für unterschiedliche Untereinheiten des SWI/SNF-Komplexes kodieren, der maßgeblich an der Remodellierung von Chromatin beteiligt ist. Die entsprechenden Gene sollen in hES-Zellen funktional deletiert bzw. überexprimiert oder in ihrer Expression gehemmt, die hES-Zellen in Neurone differenziert und die entstehenden Neurone umfassend charakterisiert werden, u. a. bezüglich ihrer Genexpressionsmuster, der DNA-Methylierungs- und Nukleosomenprofile sowie von Histonmodifikationen. Genregionen, die bezüglich dieser Eigenschaften Veränderungen gegenüber Wildtyp-Zellen aufweisen, sollen dann hinsichtlich ihres Einflusses auf die neurale Differenzierung analysiert werden, beispielsweise durch knock out oder knock down der Genexpression bzw. durch gezieltes epigenetisches editing.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen dienen hochrangigen Forschungszielen in der Grundlagenforschung.

Ziel des Forschungsvorhabens ist die Aufklärung molekularer und zellbiologischer Ursachen von Intelligenzminderungssyndromen, die durch Veränderungen im Nukleosomenprofil hervorgerufen werden. Im Mittelpunkt der Untersuchungen stehen dabei die Retardierungssyndrome Coffin-Siris und Nicolaides-Baraitser. Genetische und biochemische Befunde weisen darauf hin, dass diesen Syndromen, trotz unterschiedlicher genetischer Ursachen, gemeinsame pathologische Mechanismen zugrunde liegen. Bislang konnten diese jedoch nicht vollständig entschlüsselt werden.

Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten sollen die Funktionen der Produkte von Genen, die bei Coffin-Siris- bzw. Nicolaides-Baraitser-Syndrom verändert sind, bei der Entwicklung und für die Funktion neuronaler Zellen untersucht werden. Die entsprechenden krankheitsassoziierten Gene sollen in hES-Zellen funktional ausgeschaltet, ggf. patientenspezifisch mutiert oder hinsichtlich ihrer Expressionsstärke verändert werden. Nach Differenzierung der so veränderten hES-Zellen zu Neuronen bzw. neuronalen Organoiden sollen diese umfassend und im Vergleich mit aus Wildtyp-hES-Zellen erzeugten Neuronen/Organoiden charakterisiert werden. Ziel ist es, die Konsequenzen der genetischen Veränderungen für die neuronale Differenzierung, beispielsweise für die Genese von neuronalen Vorläuferzellen und die Effizienz der Entstehung von Neuronen verschiedener Subtypen, sowie für die Eigenschaften der entsprechenden neuronalen Zellen im Detail zu bestimmen.

Da sowohl beim Coffin-Siris- als auch beim Nicolaides-Baraitser-Syndrom Mutationen in Genen auftreten, deren Produkte zu unterschiedlichen Untereinheiten des SWI/SNF-Chromatin-Remodellierungs-Komplexes beitragen, liegt ein Schwerpunkt der hier geplanten Untersuchungen auf der Analyse möglicher Veränderungen im SWI/SNF-Komplex, in der Nukleosomenverteilung und im Histonbesatz. Dabei soll insbesondere geklärt werden, ob es infolge der jeweiligen genetischen Modifikationen zu Veränderungen in der Zusammensetzung und möglicherweise in der Funktion und Zielgen-Spezifität des SWI/SNF-Chromatin-Remodellierungs-Komplexes kommt, was zu veränderten Nukleosomenprofilen und, in Folge davon, zu Veränderungen in der Genexpression und in der DNA-Methylierung führen könnte. Dabei soll auch geklärt werden, ob verschiedene Subtypen neuronaler Zellen in gleichem Maße von solchen potentiellen Veränderungen betroffen sind.

Neben Erkenntnissen über die durch die jeweiligen Mutationen hervorgerufenen epigenetischen und transkriptionellen Veränderungen, die zur Pathogenese der genannten Syndrome beitragen könnten, sollen die genehmigten Arbeiten auch zur Identifizierung von Zielgenen beitragen, deren Funktion und Aktivität infolge der initial vorgenommenen Mutationen beeinträchtigt ist. Auf diesem Wege lassen sich ggf. Veränderungen in intrazellulären Signalkaskaden bestimmen, die ebenfalls zur Entstehung der o. g. Erkrankungen beitragen können. Insgesamt dienen die Arbeiten dazu, die molekularen und zellulären Pathogenesemechanismen der Intelligenzminderung, die auf Veränderung des Nukleosomenprofils zurückzuführen sind, besser als bislang zu verstehen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Beim Coffin-Siris-Syndrom wurden bei Patienten Mutationen in mehreren Genen gefunden, die für verschiedene Bestandteile des Chromatin-regulierenden SWI/SNF-Komplexes kodieren, der eine zentrale Rolle bei der Regulation der Transkription auf der Ebene des Epigenoms spielt. Im Mausmodell wurde gezeigt, dass die Funktion dieses Komplexes für die Proliferation und Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen und somit für die Ausbildung des Vorderhirns essentiell ist. In der wissenschaftlichen Literatur wurden Mutationen in verschiedenen Genen beschrieben, die in den o. g. Syndromen auftreten und deren Funktion hier detailliert untersucht werden soll. So treten beispielsweise Mutationen in ARID1B in einem überwiegenden Teil der Patienten mit Coffin-Siris-Syndrom auf. Durch Exom-Sequenzierungen wurden auch Mutationen im SOX11-Gen nachgewiesen, das für einen Transkriptionsfaktor codiert, der an der Regulierung der Neurogenese beteiligt ist; zudem ist SOX11 ein direktes Zielgen des SWI/SNF-Komplexes. Für das Nicolaides-Baraitser-Syndrom wurde gezeigt, dass hauptsächlich Mutationen im SMARCA2-Gen, das ebenfalls für eine Untereinheit des SWI/SNF-Komplexes kodiert, ursächlich für die Erkrankung sind.

Protokolle für die Gewinnung von neuronalen (Vorläufer)Zellen und Gehirn-Organoiden wurden in der wissenschaftlichen Literatur publiziert und sind beim Genehmigungsinhaber bereits teilweise etabliert. Effektive Vorgehensweisen für die genetische Modifikation von hES-Zellen, beispielsweise unter Einsatz der CRISPR/Cas9-Technologie, sind vielfach publiziert worden. Die Vorgehensweisen für die Charakterisierung der differenzierten neuronalen Zellen sind ebenfalls etabliert.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Notwendigkeit der Verwendung humaner Zellen zur Erreichung der Forschungsziele ergibt sich aus der Spezies-Spezifität von Prozessen der neuralen Differenzierung und humanspezifischen neurologischen und mentalen Veränderungen, die bei den hier interessierenden Syndromen auftreten. Die Notwendigkeit zur Nutzung humaner pluripotenter Stammzellen folgt aus der Tatsache, dass andere in Frage kommende Stammzellen des Menschen, beispielsweise neurale Stammzellen aus abgetrieben Föten, nicht in der für die Projektdurchführung erforderlichen Menge und in reproduzierbarer Qualität verfügbar sind. Zudem haben solche Zellen die (hier interessierenden) Prozesse der frühen neuronalen Entwicklung bereits durchlaufen und sind einer genetischen Veränderung und der Etablierung stabil veränderter (nicht-immortalisierter) Zell-Linien nicht im selben Maße zugänglich wie pluripotente Stammzellen. Zudem gibt es derzeit keine Hinweise darauf, dass die für die Klärung der Forschungsfragen erforderlichen zerebralen Organoide aus anderen als humanen pluripotenten Stammzellen gewonnen werden könnten.

Nach derzeitigem Kenntnisstand können die Forschungsziele auch nicht unter Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erreicht werden. Da Effekte von krankheitsauslösenden Mutationen auf das neurale Differenzierungspotential untersucht werden sollen, sind Zellen erforderlich, die möglichst ursprüngliche Charakteristika aufweisen. hiPS-Zellen können jedoch zum einen Mutationen enthalten, die bereits in den zur Reprogrammierung genutzten somatischen Zellen vorhanden sind. Die Tatsache, dass es bei Vorliegen identischer genetischer Defekte in mit Intelligenzminderungssyndromen assoziierten Genen zu einer teils sehr unterschiedlichen Ausprägung der Krankheit kommt, lässt zum anderen darauf schließen, dass weitere Faktoren die Penetranz der Mutation beeinflussen könnten. Zudem ist die epigenetische Integrität der für Klärung der Forschungsfragen genutzten Zellen von entscheidender Relevanz, da die mit den hier interessierenden Erkrankungen einhergehenden Veränderungen vor allem in Prozessen der Chromatin-Remodellierung, also auf epigenetischer Ebene, erwartet werden. Wildtyp-hiPS-Zellen haben aber außer einem unbestimmten genetischen Hintergrund eine große epigenetische Variabilität und weisen, beispielsweise infolge einer unvollständigen Reprogrammierung der somatischen Ausgangszellen, ein von hES-Zellen verschiedenes und möglicherweise weniger ursprüngliches Epigenom als hES-Zellen auf.

Stand: 05.07.2018

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