128. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaberin

Frau Dr. Michelle Vincendeau, Helmholtz Zentrum München GmbH

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HUES8 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES9 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)

Die Genehmigung gilt auch für die Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Der Schwerpunkt der genehmigten Forschungsarbeiten liegt auf der Untersuchung der Funktionen von im humanen Genom anzutreffenden Retrotransposons bzw. der Rolle der von diesen codierten Genprodukten bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz und bei der neuralen Differenzierung menschlicher Zellen. Hierfür soll in einem ersten Teilprojekt zunächst untersucht werden, ob und inwieweit sich die Expression der Retrotransposons während der neuralen Differenzierung humaner ES-Zellen verändert. Dazu soll die Expression der Retrotransposons unter Einsatz eines modifizierten CRISPR/Cas-Systems in hES-Zellen spezifisch aktiviert bzw. gehemmt und die Effekte auf das Transkriptom und Epigenom der sich neural differenzierenden Zellen untersucht werden. Außer in neurale Zellen sollen hES-Zellen zu Kontrollzwecken auch in mesodermale Vorläuferzellen, Kardiomyozyten und Hepatozyten differenziert werden. In einem zweiten Teilprojekt sollen die Funktionen von Retrotransposons, von durch Retrotransposons regulierten zellulären Genen, sowie von Genen untersucht werden, die (bekanntermaßen oder mutmaßlich) ihrerseits Retrotransposons regulieren. Die entsprechenden Gene sollen in hES-Zellen überexprimiert, mutiert oder ausgeschaltet und die Effekte auf die Eigenschaften der aus den entsprechenden hES-Zellen differenzierten Zellen bestimmt werden. Dabei richtet sich das Interesse wiederum auf mögliche Veränderungen des Transkriptoms und des Epigenoms sowie auf weitere molekulare und funktionale Eigenschaften der Zellen. Die genetisch veränderten hES-Zellen, die im Rahmen beider Teilprojekte hergestellt wurden, sollen auch für die Erzeugung von Gehirn-Organoiden genutzt werden, wobei die Effekte einer veränderten Expression von Retrotransposons sowie die Auswirkungen veränderter Genfunktionen auf die Eigenschaften der jeweiligen Gehirn-Organoide bestimmt werden sollen.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen in der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Das Ziel der Forschungsarbeiten besteht in der Klärung der Fragestellung, ob und auf welche Weise im menschlichen Genom befindliche Retrotransposons, und hier insbesondere humane endogene Retroviren (HERV), zur Aufrechterhaltung der Pluripotenz menschlicher ES-Zellen beitragen und die neurale Differenzierung menschlicher Zellen modulieren oder ggf. steuern können.

Im ersten Teil des hier beantragten Projektes soll zunächst untersucht werden, welche Retrotransposon-Gene in pluripotenten Stammzellen aktiv sind und ob sich ihre Expression im Zuge der neuralen Differenzierung ändert. Daraus könnten sich bereits erste Anhaltspunkte für die Regulation neuraler Differenzierungsvorgänge ergeben. Auf Grundlage der dabei gewonnenen Ergebnisse sollen dann differentiell exprimierte retrovirale Gene ausgewählt und ihre Expression in hES-Zellen entweder aktiviert oder gehemmt werden. Anschließend sollen die Effekte dieser gezielten Veränderung der Genexpression auf Pluripotenz und neurale Differenzierung bestimmt werden. Aus diesen Untersuchungen lassen sich aller Voraussicht nach Erkenntnisse über Funktionen bestimmter Genprodukte gewinnen, die von Retrotransposons entweder codiert werden oder deren Expression durch cis-Effekte retroviraler Sequenzen reguliert wird. Dies lässt ggf. Rückschlüsse auf molekulare Grundlagen früher Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse beim Menschen zu.

Im zweiten Teil des Vorhabens soll geklärt werden, welche Konsequenzen die Überexpression, Deletion oder gerichtete Mutagenese von Genen hat, die mutmaßlich in die Regulation insbesondere von neuraler Differenzierung durch Retrotransposons involviert sind. Dabei sollen zunächst von retroviralen Sequenzen codierte Gene ektopisch überexprimiert, in ihrer Expression (beispielsweise durch siRNA) gehemmt oder so mutiert werden, dass kein funktionales Genprodukt mehr gebildet werden kann. Nach Differenzierung in Richtung neuraler Zellen sollen dann insbesondere das Transkriptom und das Epigenom mit jenen von Wildtyp-Zellen verglichen und auf diesem Wege Retrotransposons identifiziert werden, deren Produkte die neurale Differenzierung, beeinflussen. Diese Untersuchungen sollen dann auf solche Gene ausgedehnt werden, deren Transkription infolge einer veränderten Expression/Regulation retroviraler Sequenzen verändert ist und die folglich bei der Vermittlung der Effekte von Retrotransposons auf die Differenzierung eine Funktion haben könnten. Aus diesen Untersuchungen werden Erkenntnisse über Effektoren von Retroviren sowie über Moleküle und Signalwege erwartet, die in Differenzierungsprozesse involviert sind und deren Aktivität im Menschen durch Retrotransposons beeinflusst oder bestimmt wird. Ferner soll untersucht werden, welche Konsequenzen die Überexpression, Deletion oder zielgerichtete Mutation von Genen hat, die für Faktoren codieren, die ihrerseits die Aktivität von Retrotransposons im menschlichen Genom kontrollieren. Daraus sollen Schlussfolgerungen über die molekularen Grundlagen der Regulation der Aktivität, beispielsweise von humanen endogenen Retroviren (HERVs) gezogen werden und letztlich der Zusammenhang zwischen transkriptioneller bzw. epigenetischer Kontrolle von retroviralen Genaktivitäten und biologischen Prozessen wie Pluripotenz und Differenzierung beschrieben werden.

Die oben beschriebenen Fragestellungen zur Rolle von Retrotransposons während der neuralen Differenzierung sollen auch in Kontext sich entwickelnder neuronaler Organoide untersucht werden. Hierzu sollen die in beiden Teilprojekten erzeugten genetisch veränderten hES-Zellen in humane Gehirn-Organoide differenziert und diese beispielsweise hinsichtlich ihrer Morphologie und der Präsenz spezifischer Zelltypen untersucht werden. Auch aus diesen Arbeiten lassen sich aller Voraussicht nach Erkenntnisse darüber ableiten, inwieweit neurale Entwicklungsprozesse beim Menschen durch bestimmte Retrotransposons beeinflusst werden und ob die in herkömmlicher Zellkultur beobachteten Phänomene sich auch in einem deutlich komplexeren 3D-Modell bestätigen lassen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Aus Studien an Nagerzellen liegen seit mehr als 10 Jahren proof-of-concept-Studien vor, in denen gezeigt wurde, dass die Aktivität von bestimmten Retrotransposons mit variierenden Genexpressionsmustern und veränderten Differenzierungsentscheidungen in neuralen Vorläuferzellen verbunden ist. Die Aktivität der endogenen retroviralen Elemente ist dabei auch von der Aktivität epigenetischer Faktoren abhängig. Ein heterozygoter knock out eines entsprechendes Gens führte beispielsweise zu einer verstärkten Aktivität endogener Retroviren und zu einer veränderten Expression von benachbarten Genen. Die Tatsache, dass sich Retrotransposons in Maus und Mensch bezüglich ihrer Anzahl, Verteilung und Aktivität stark unterscheiden und dass der Schwerpunkt der hier geplanten Arbeiten auf der Untersuchung humanspezifischer Retrotransposons liegt, lässt eine über einen proof of concept hinausgehende Vorklärung der Forschungsarbeiten an murinen Zellen als nicht zielführend erscheinen. Zudem hat die Genehmigungsinhaberin Ergebnisse eigener (in den USA durchgeführter) Arbeiten unter Verwendung von hES-Zellen aufgeführt, die auf eine Beteiligung humaner endogener Retroviren an neuralen Differenzierungsprozessen in Menschen hindeuten. Die hier genehmigten Forschungsarbeiten schließen nahtlos an die bislang durchgeführten Forschungsarbeiten zu diesen Fragen an.

Die zum Einsatz kommenden Vorgehensweisen für die genetischen Veränderungen an hES-Zellen sind bereits etabliert. Dies betrifft insbesondere das Vorgehen für die CRISPR-abhängige Aktivierung bzw. Hemmung von Genaktivitäten. Der proof of concept, dass dieses System zur Regulierung der Aktivität spezifischer Retroviren genutzt werden kann, wurde bereits erbracht. Protokolle für die Differenzierung humaner ES-Zellen in verschiedene Typen neuraler Zellen sowie Methoden zur Erzeugung neuraler Organoide aus hES-Zellen sind publiziert.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Erreichung der Forschungsziele erfordert die Verwendung menschlicher Zellen, da hinsichtlich von Art, Anzahl, Verteilung und Aktivität endogener Retroviren erhebliche Unterschiede zwischen Spezies bestehen. Die Forschungsziele können auch nicht unter Nutzung anderer als humaner pluripotenter Stammzellen erreicht werden. Die Untersuchung des Einflusses von Retrotransposons soll in allen Phasen der neuralen Differenzierung erfolgen, von pluripotenten Stammzellen bis hin zu terminal differenzierten Neuronen. Das hierfür erforderliche Differenzierungspotential haben aber weder adulte oder fötale (neurale) Stammzellen noch bislang verfügbare (immortalisierte) neurale Stammzell-Linien des Menschen. Auch die Herstellung von neuralen Organoiden ist bislang nur unter Nutzung pluripotenter Stammzellen als Ausgangsmaterial gelungen.

Nach gegenwärtigem Kenntnisstand liegen auch keine ausreichenden Hinweise darauf vor, dass sich die Forschungsziele unter Nutzung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) erreichen ließen. Die Regulation der Aktivität von Retrotransposons erfolgt maßgeblich auf epigenetischer Ebene. Gerade hinsichtlich epigenetischer Eigenschaften bestehen aber teils Unterschiede zwischen hES- und hiPS-Zellen, die durch eine ggf. unvollständige Reprogrammierung bedingt sind. Zum anderen wurde bereits gezeigt, dass im Ergebnis des Reprogrammierungsprozesses bestimmte Retrotransposons in hiPS-Zellen – anders als in hES-Zellen – aktiv sind, was eine der Ursachen für die häufig beobachtete starke Heterogenität verschiedener hiPS-Zell-Linien sein könnte. Da im Rahmen des Forschungsvorhabens jedoch mögliche Funktionen von Retrotransposons während der neuralen Differenzierung aufgeklärt und daraus Schlüsse auf entsprechende Entwicklungsvorgänge im menschlichen Embryo gezogen werden sollen, ist die Nutzung eines Materials erforderlich, in dem die Aktivität der endogenen Retroviren möglichst authentisch ist bzw. authentisch reguliert wird. Hierfür sind aber nach derzeitigem Kenntnisstand hES-Zellen besser geeignet als hiPS-Zellen.

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