125. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Max-Delbrück-Zentrum für Molekulare Medizin (MDC), Berlin

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt auch für die Verwendung von Sub-Linien (z. B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten soll die Rolle des humanen endogenen Retrovirus H (HERV-H) für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz humaner embryonaler Stammzellen untersucht werden. Auf Grundlage von in der Vergangenheit durchgeführten Transkriptom-Vergleichen soll in einem ersten Projektteil die Funktion der Produkte von spezifischen Genen, die bei An- und Abwesenheit von HERV-H in pluripotenten Stammzellen des Menschen unterschiedlich exprimiert werden, für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz menschlicher Zellen bestimmt werden. Die entsprechenden Gene sollen in hES-Zellen überexprimiert bzw. ihre Expression vermindert oder ausgeschaltet und die jeweiligen Effekte auf die Eigenschaften von hES-Zellen bestimmt werden. Zudem sollen Wechselwirkungspartner der entsprechenden Genprodukte in hES-Zellen identifiziert sowie ihre Eigenschaften, beispielsweise die Funktion für den Metabolismus humaner ES-Zellen, im Hochdurchsatzverfahren untersucht werden.

In einem zweiten Projektteil soll dann geklärt werden, welche Effekte die induzierte Überexpression des Gens für den Transkriptionsfaktor LBP9 bei gleichzeitigem knock out bzw. knockdown des endogenen LBP9-Gens u. a. auf das Transkriptom der Zellen hat. Für LBP9 wird eine Funktion in der Aufrechterhaltung naiver (ursprünglicher) Pluripotenz menschlicher Stammzellen vermutet. In diesem Zusammenhang soll gleichfalls bestimmt werden, welche Konsequenzen die (ggf. partielle) Ausschaltung des (mit LBP9 verwandten) Transkriptionsfaktors TFCP2 für die Eigenschaften von hES-Zellen hat. Für TFCP2 wird eine Funktion bei der Aufrechterhaltung geprägter (primed) Pluripotenz von hES-Zellen angenommen. Hier sollen entsprechende knock out-Zellinien hergestellt, die für Pluripotenz maßgeblichen Eigenschaften der genetisch veränderten Zellen untersucht und ihr Differenzierungsverhalten bewertet werden. Zudem sollen die DNA-Bindungsstellen von TFCP2 im hES-Zell-Genom identifiziert werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen in der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Bereits in früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass der Verlust der HERV-H-Transkripte infolge eines shRNA-vermittelten knock down mit dem Verlust von Pluripotenz verbunden war. In diesem Zusammenhang waren bereits mehrere Gene identifiziert worden, die infolge des knock down der Expression von HERV-H ebenfalls in geringerem Maße exprimiert wurden. Einige dieser Gene sollen nun in hES-Zellen entweder konditional überexprimiert oder ausgeschaltet bzw. in ihrer Expression vermindert werden. Durch Untersuchung der resultierenden Effekte auf das Transkriptom der hES-Zellen sollen mögliche downstream-Effekte einer durch die Aktivität von HERV-H veränderten Genaktivität analysiert und auf diesem Wege die Funktion der entsprechenden Gene näher bestimmt werden. Dies wird vermutlich Einblicke in die Grundlagen der Regulation von Pluripotenz menschlicher Zellen durch HERV-H erlauben.

Eines der Gene, das unter Kontrolle einer HERV-H-LTR steht und dessen Expression offenbar durch HERV-H reguliert wird, ist ESRG (embryonic stem cell related gene), das ausschließlich in hES-Zellen exprimiert wird. Die Frage, ob das ESRG-Genprodukt seine potentielle Wirkung als nicht-codierende RNA entfaltet oder ob ein entsprechendes Protein existiert, ist bislang nicht geklärt. Ferner existieren in hES-Zellen mehrere ESRG-Transkripte, deren Funktion bislang ebenfalls nicht bekannt ist. Daher sollen Natur und Lokalisation der ESRG-Transkripte geklärt und überprüft werden, welche Protein-Isoformen für ESRG vorliegen und wo die Proteine in der Zelle lokalisiert sind. Dies soll zur Beantwortung der Frage nach möglichen Funktionen von ESRG-Genprodukten in hES-Zellen beitragen. Weiterhin bestehen Anhaltspunkte dafür, dass ESRG eine Rolle im Stoffwechsel von hES-Zellen spielt, da es offenbar physisch mit der Untereinheit II der Zytochrom-Oxydase (COXII) interagiert. Aus diesem Grunde soll im Hochdurchsatzverfahren überprüft werden, ob das Metabolom von hES-Zellen bei Ausschaltung oder Überexpression von ESRG Veränderungen aufweist. Diese Untersuchungen sollen dazu beitragen, neue Erkenntnisse über Funktionen von ESRG im Zellstoffwechsel zu gewinnen. Da das hypothetische ESRG-Protein offenbar partielle Ähnlichkeit mit einer Methyltransferase hat, soll zudem untersucht werden, ob die Präsenz von ESRG-Genprodukten ggf. mit Veränderungen im Epigenom einhergehen und ob und wenn ja welche Wechselwirkungen die ESRG-Genprodukte mit Faktoren eingehen, die an der Modulation des Epigenoms beteiligt sind. Diese Untersuchungen können voraussichtlich dazu beitragen, ein tieferes Verständnis über Funktionen von ESRG bei der epigenetischen Regulation von Pluripotenz zu gewinnen.

Im weiteren sollen die Funktionen von LBP9 bei der Aufrechterhaltung von Pluripotenz untersucht werden. Durch konditionale Überexpression eines LBP9-Gens bei gleichzeitiger Ausschaltung der endogenen LBP9-Genexpression soll ein hES-Zellmodell geschaffen werden, in dem durch Produktion variabler Mengen an LBP9 der Einfluss von LBP9 auf die Pluripotenz detailliert untersucht werden kann. Es wird angenommen, dass LBP9 vor allem für die Aufrechterhaltung naiver Pluripotenz von erheblicher Bedeutung ist und, da dieses Gen ausschließlich im Menschen existiert, die Aktivität von LBP9 ein Schlüssel für die humanspezifische Regulation von Pluripotenz sein könnte. Die Untersuchung des jeweligen Transkriptoms sowie des Spektrums der DNA-Bindung von Transkriptionsfaktoren in hES-Zellen, die das LBP9-Gen in unterschiedlichem Maße exprimieren, soll Auskunft darüber erbringen, wie sich Veränderungen in der LBP9-Genexpression auf die molekularen Eigenschaften von hES-Zellen auswirken. Durch diese Arbeiten könnten mögliche Zusammenhänge zwischen der Ausprägung naiver Pluripotenz und der Expression spezifischer (ggf. HERV-H-abhängiger) Gene aufgedeckt werden.

Schließlich soll überprüft werden, ob der Transkriptionsfaktor TFCP2 ebenfalls Funktionen bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz von hES-Zellen hat. Den Arbeiten liegt die plausible Vermutung zugrunde, dass TFCP2 vor allem für die Aufrechterhaltung von geprägter Pluripotenz maßgeblich ist. Durch Ausschaltung oder Verminderung der TFCP2-Genexpression soll ermittelt werden, auf welche Art TFCP2 die Genexpression in hES-Zellen beeinflusst und ob eine verminderte TFCP2-Genexpression zum Verlust von Pluripotenz und zu einem veränderten Differenzierungsverhalten führt. Auch diese Arbeiten sollen dazu beitragen, ein vertieftes Verständnis über die molekularen Grundlagen von zellulärer Pluripotenz beim Menschen zu gewinnen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Ausgangspunkt für die geplanten Forschungsarbeiten sind frühere Untersuchungen unter Nutzung von hES-Zellen, in denen gezeigt wurde, dass naive Pluripotenz in hES-Zellen offenbar mit einer verstärkten Expression von HERV-H-Genen einhergeht und dass die HERV-H-abhängige Expression bei naiver Pluripotenz erhöht ist. Ferner wurden verschiedene humanspezifische Transkripte identifiziert, die durch HERV-H kontrolliert werden und die in hES-Zellen in verstärktem Maße nachweisbar sind. Zudem wurden deutliche Hinweise auf die maßgebliche Rolle von LBP9 für die Expression HERV-H-abhängiger Gene gefunden, und es wird eine Beteiligung von LBP9 an der Aufrechterhaltung naiver Pluripotenz postuliert. Die erhebliche Relevanz von HERV-H für die Pluripotenz menschlicher Zellen wurde auch in weiteren Studien nachgewiesen. ESGR ist zudem als für hES-Zellen charakteristisches Protein bereits vor ca. 10 Jahren identifiziert worden, weitere Publikationen zur Charakterisierung von ESGR liegen vor. Die benannten Ergebnisse sind Ausgangspunkt für die nun genehmigten Forschungsarbeiten und stellen eine Fortführung bisheriger Arbeiten auf diesem Gebiet dar.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Erreichung der Forschungsziele erfordert die Verwendung menschlicher Zellen, da hier humanspezifische molekulare und zellbiologische Prozesse untersucht werden sollen, die an der Regulation humaner Pluripotenz beteiligt sind. Im Mittelpunkt der Untersuchungen steht zudem die Untersuchung humanspezifische Gene bzw. Transkripte. Ferner sind HERV primatenspezifische endogene Retroviren, und es bestehen erhebliche und gut dokumentierte Spezies-Unterschiede bei der Regulation zellulärer Pluripotenz. Fragen zu Grundlagen von Pluripotenz beim Menschen können auch nicht an anderen als pluripotenten Stammzellen des Menschen (adulten oder fötalen Stammzellen) geklärt werden, da diese Zellen das hier interessierende Stadium der Pluripotenz bereits durchlaufen haben.  Nach gegenwärtigem Kenntnisstand liegen auch keine ausreichenden Hinweise darauf vor, dass sich die Forschungsziele unter Nutzung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) erreichen ließen. Untersuchungen zu Grundlagen von zellulärer Pluripotenz beim Menschen erfordern Zellen, die sehr ursprünglich sind und der natürlich (in vivo vorliegenden) Situation möglichst nahekommen. Dafür sind nach derzeitigem Kenntnisstand aber hES-Zellen, die aus einem frühen menschlichen Embryo stammen, deutlich besser geeignet als hiPS-Zellen, die durch Reprogrammierung i. allg. aus somatischen Zellen wie Hautfibroblasten gewonnen werden. Bei hiPS-Zellen besteht zudem eine erhebliche Variabilität der mit Pluripotenz assoziierten Eigenschaften (beispielsweise im Differenzierungspotential), die ihre Ursache ggf. in einer teils nicht-authentischen Regulation der Pluripotenz haben könnte und die beispielsweise auf eine unvollständige Reprogrammierung zurückgeführt werden kann. Zudem stellt die reprogrammierungsbedingte De-novo-Mutagenese ein in hiPS-Zellen vielfach beobachtetes Phänomen dar, dessen Konsequenzen für die Nutzbarkeit der jeweiligen hiPS-Zell-Linie nicht vorhergesagt werden können.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterungen vom 21.01.2020 und 24.02.2021

Die Genehmigungserweiterungen beziehen sich auf die Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Im Rahmen der Durchführung der genehmigten Forschungsarbeiten wurde u. a. festgestellt, dass das Produkt des durch HERV-H regulierten Gens ESRG mit Proteinen interagiert, die an der Aufrechterhaltung der Telomeren beteiligt sind, was einen ESRG-vermittelten Mechanismus der Aufrechterhaltung der Pluripotenz über die Regulation der Länge der Telomeren vermuten lässt. Zudem besteht offenbar eine negative Korrelation zwischen der Expression von HERV-H und der Aktivität von LINE1(L1)-Retrotransposons, und humane frühembryonale Zellen mit geringer HERV-H-Genexpression und hoher L1-Retrotranspositionsaktivität weisen in vivo eine starke Präsenz von Apoptose-Markern auf. Es wird daher vermutet, dass die Präsenz von HERV-H die Aktivität phylogenetisch junger transponierbarer Elemente wie beispielsweise L1 kontrolliert, frühe embryonale Zellen vor Apoptose  schützt und auch auf diesem Wege zur Aufrechterhaltung der Pluripotenz beiträgt. Dies soll nun experimentell bestätigt werden, indem die Aktivität von L1- (und ggf. weiterer phylogenetisch junger) Retrotransposons in hES-Zellen mit und ohne (bzw. mit verminderter) HRERV-H-Expression bestimmt, das Auftreten von mit verstärkter Apoptose in Zusammenhang stehenden DNA-Doppelstrangbrüchen analysiert und die Präsenz von Apoptose-Markern untersucht werden. Zudem sollen die Konsequenzen eines knock out / knock down des Gens für ESRG auf die Telomeren-Länge in hES-Zellen untersucht werden. Im Rahmen einer erneuten Erweiterung der Genehmigung wurde die Verwendung von hES-Zellen zur Durchführung von Kontrollexperimenten genehmigt, mit denen die Forschungsergebnisse weiter verifiziert werden sollen.  

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Das Ziel der Forschungsarbeiten bleibt grundsätzlich unverändert. Die Arbeiten sollen auf zusätzliche Aspekte ausgedehnt werden, die sich im Rahmen der Durchführung der bislang genehmigten Forschungsarbeiten und im Ergebnis der Analysen öffentlich verfügbarerer RNAseq-Daten als potentiell relevant ergeben haben. Dabei soll zum einen geklärt werden, ob eine erhöhte L1-Transposition, die mit einem verstärkten Auftreten von DNA-Doppelstrangbrüchen einhergeht und mit verstärkter Apoptose-Aktivität  assoziiert ist, wird vermutet, durch HERV-H unterdrückt und auf diesem Wege zur Aufrechterhaltung einer (ggf. naiven) pluripotenten Stammzell-Population beigetragen wird. Zum anderen sind die Forschungsarbeiten darauf gerichtet, eine bislang nicht bekannte mögliche Funktion des ESRG-Genproduktes bei der Regulation der Telomeren-Länge zu belegen. Da HERV-H die Expression des ESRG-Gens kontrolliert, könnte eine Verminderung der HERV-H-Genexpression und eine damit einhergehende verringerte Expression des ESRG-Gens zu einem Abbau der Telomeren und, in der Folge, zu Seneszenz und Verlust der Pluripotenz führen. Die entsprechenden Experimente sollen  entsprechende Hinweise auf die mechanistischen Grundlagen der Regulation von Pluripotenz durch HERV-H erbringen und ein tieferes Verständnis über Funktionen von ESRG bei der Regulation von Pluripotenz in menschlichen Zellen ermöglichen. Insgesamt sollen die Forschungsarbeiten hochrangige neue Erkenntnisse über die Rolle von HERV-H während der Entwicklung früher embryonaler Zellen des Menschen erbringen, die auch von entwicklungsbiologischer Relevanz sein können. 

Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde umfassend dargelegt, dass eine negative Korrelation zwischen der Expression der HERV-H-Gene und der Aktivität jüngerer Retrotransposons besteht und dass eine Abnahme der HERV-H-Expression bereits im 8-Zell- und Morula-Stadium erfolgt, wobei gleichzeitig eine verstärkte Aktivität jüngerer Retrotransposon beobachtet werden kann. Die Assoziation insbesondere der L1-Aktivität mit DNA-Doppelstrangbrüchen ist durch Literatur belegt. Aus den Ergebnissen der bislang genehmigten Arbeiten ergaben sich zudem Hinweise auf eine Assoziation von ESRG mit Proteinen, die an der Regulation der Telomeren-Länge beteiligt sind. Die Aufrechterhaltung der Telomeren ist eine für zelluläre Pluripotenz unabdingbare Notwendigkeit, und die erhobenen Befunde weisen somit auf einen bislang unbekannten Mechanismus der Pluripotenz-Regulation durch ESRG (und damit durch HREV-H) hin. Die geplanten Arbeiten stellen eine konsequente Fortsetzung bereits genehmigter Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen dar.

Die Notwendigkeit, hES-Zellen zu verwenden, wurde im ursprünglichen Antrag umfassend dargelegt und ergibt sich vor allem aus dem Ziel, sehr frühe Entwicklungsprozesse in pluripotenten Stammzellen des Menschen bezüglich ihrer molekularen Grundlagen zu beleuchten. Die Erreichung der Forschungsziele unter Verwendung tierischer Zellen, insbesondere von pluripotenten Stammzellen der Maus, ist weiterhin nicht möglich, da in der Entwicklung des frühen Embryos erhebliche speziesspezifische Unterschiede bestehen. Nicht-pluripotente menschliche Zellen können ebenfalls weiterhin nicht zur Erreichung der Forschungsziele verwendet werden, da sie die hier interessierenden zellulären Entwicklungsstadien bereits durchschritten haben. Nach gegenwärtigem Kenntnisstand liegen weiterhin auch keine ausreichenden Hinweise darauf vor, dass sich die Forschungsziele unter Nutzung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erreichen ließen. Untersuchungen zu Grundlagen von zellulärer Pluripotenz beim Menschen erfordern nach wie vor humane Zellen, die sehr ursprünglich sind und der natürlich (in vivo vorliegenden) Situation möglichst nahekommen. Dies sind nach derzeitigem Kenntnisstand hES-Zellen, da hiPS-Zellen eine teils erhebliche Variabilität in den für Pluripotenz maßgeblichen Eigenschaften zeigen, reprogrammierungsbedingte De-novo-Mutationen mit nicht vorhersagbaren Konsequenzen für die Nutzbarkeit der jeweiligen hiPS-Zell-Linie enthalten können und epigenetische  Besonderheiten aufweisen. Zudem wurde bereits gezeigt, dass die Herstellung von hiPS-Zellen mit einer (ggf. artifiziellen) Aktivierung  von L1-Retrotransppsons verbunden ist, was hier zu artifiziellen Resultaten führen könnte.

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