123. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Frau Dr. Insa S. Schröder, GSI Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung GmbH, Darmstadt

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H7 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H14 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• hESBGN-01 (Bresagen, Inc., Athen, GA, USA)
• hESBGN-02 (Bresagen, Inc., Athen, GA, USA)
• HS181 (Karolinska-Institut, Stockholm, Schweden)
  
• HS401 (Karolinska-Institut, Stockholm, Schweden)
• HS415 (Karolinska-Institut, Stockholm, Schweden)
• HUES2 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES3 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES4 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES6 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES9 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES14 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• I3 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I6 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• NCL-3 (Newcastle Fertility Centre, Newcastle, Großbritannien)
• NCL-4 (Newcastle Fertility Centre, Newcastle, Großbritannien)

Die Genehmigung gilt auch für die Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten sollen die zellulären und molekularen Grundlagen der Schädigung von Zellen des menschlichen  Zentralnervensystems (ZNS) durch ionisierende Strahlung und Chemotherapeutika untersucht werden, die in der Therapie von Hirntumoren zum Einsatz kommen. Dazu sollen humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) in verschiedene Typen neuronaler und glialer Zellen sowie in Zellen der Mikroglia differenziert und dabei die experimentellen Vorgehensweisen für die Gewinnung solcher Zellen weiter optimiert werden. In diesem Zusammenhang soll auch ein Protokoll für die Gewinnung neuraler Vorläuferzellen (NVZ) eines möglichst adulten Phänotyps aus pluripotenten Stammzellen etabliert werden. Ferner ist die Herstellung zerebraler Organoide auf der Grundlage publizierter Protokolle geplant. Die Integrität der jeweils gewonnenen Zel­len/Organoide soll umfassend überprüft werden. Die verschiedenen Zelltypen des ZNS sowie die zerebralen Organoide sollen dann bezüglich potentieller toxischer Effekte von ionisierender Strahlung, von Chemo- und Immuntherapeutika, von in der Tumortherapie genutzten Antikonvulsiva sowie von Nanopartikeln untersucht werden. Dazu sollen (sich differenzierende und terminal differenzierte) Zellen der jeweiligen potentiellen Noxe ausgesetzt und anschließend umfassend bezüglich möglicher Veränderungen auf molekularer, morphologischer, genetischer, epigenetischer und funktionaler Ebene charakterisiert werden. Auf Basis dieser Untersuchungen sollen die Grundlagen für ein In-vitro-System zur Vorhersage und Bewertung von Schädigungen durch Strahlung und Chemotherapeutika geschaffen werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen in der Grundlagenforschung und können zudem zur Schaffung von Grundlagen für die Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren zur Anwendung bei Menschen beitragen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Schädigungen des Nervensystems und damit verbundene Langzeitschäden sind ein maßgebliches Problem des Einsatzes von ionisierender Strahlung und Chemotherapeutika zur Therapie von Hirntumoren, insbesondere bei Kindern und Jugendlichen. Die Bestrahlung des gesunden ZNS mit für die Strahlentherapie erforderlichen Dosen führt zu einer progressiven Verschlechterung der kognitiven Fähigkeiten. Auch eine Strahlenexposition im Rahmen der Diagnostik ist mit entsprechenden Risiken verbunden. Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist es, durch die Untersuchung des Einflusses von ionisierender Strahlung und von Chemotherapeutika auf menschliche Neurone in vitro ein besseres Verständnis von den unmittelbaren Auswirkungen dieser Noxen auf die molekularen und funktionalen Eigenschaften humaner neuraler Zellen zu erlangen.

Im Zusammenhang mit der Etablierung von (publizierten) Vorgehensweisen zur Gewinnung verschiedener Typen von ZNS-Neuronen sind die geplanten Arbeiten zur Entwicklung eines Protokolls für die Gewinnung von NVZ eines möglichst adulten Phänotyps aus hES-Zellen von besonderem Interesse. Adulte NVZ sind kein Überbleibsel der embryonalen Neurogenese, sondern stellen einen spezifischen Zelltyp dar, der durch Aktivierung intrinsischer neurogener Signalwege einer Differenzierung in Neurone im stark gliogenen und antineurogenen Umfeld des adulten ZNS zugänglich ist. Die Frage danach, wie adulte NVZ ihre spezifischen (und von embryonalen NVZ verschiedenen) Aufgaben wahrnehmen können (u. a. bei der Aufrechterhaltung einer stabilen Vorläuferzellpopulation über einen langen Zeitraum oder bei der flexiblen und bedarfsgerechten Produktion neuraler/neuronaler Zellen im ZNS) ist derzeit nur unzureichend verstanden und könnte bei Verfügbarkeit ausreichender Mengen adulter NVZ besser untersucht werden. Zudem könnten sich im Zuge der Entwicklung eines entsprechenden Differenzierungsprotokolls neue Erkenntnisse darüber ergeben, welche Faktoren und Signalkaskaden in den Prozess der Genese adulter NVZ involviert sind.

Im sich anschließenden Teil des Forschungsvorhabens sollen menschliche Neurone, Gliazellen und Zellen der Mikroglia genutzt werden, um Veränderungen in der Biologie dieser Zellen nach Exposition gegenüber ionisierender Strahlung und nach Behandlung mit in der Tumortherapie eingesetzten Pharmaka (Chemo- und Immuntherapeutika, Antikonvulsiva) und Nanopartikeln zu analysieren. Dadurch können zum einen jene neuralen Zelltypen identifiziert werden, die besonders empfindlich auf eine Strahlen-  bzw. Medikamentenexposition reagieren. Zum anderen können die einer potentiellen Strahlenschädigung zugrundeliegenden molekularen Ereignisse (beispielsweise chromosomale Veränderungen, Veränderungen im Epigenom und in der Expression spezifischer Gene, Ver­änderungen in den elektrophysiologischen Eigenschaften bestimmter Neurone) erfasst wer­den, wodurch sich Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen der strahlen- bzw. medikamentenbedingten Schädigung des menschlichen ZNS ergeben könnten. Ferner sind Erkenntnisse darüber zu erwarten, welche Auswirkungen die Exposition gegenüber Strahlung/Pharmaka auf spezifische Ereignisse der (adulten) Neurogenese und damit auf die Neuroregeneration haben. Auf diese Weise können mögliche Endpunkte identifiziert werden, die für eine verlässliche Vorhersage neurotoxischer Effekte einer Therapie mit Strahlen und/oder Chemo-/Immuntherapeutika  genutzt werden könnten. Dies ist wiederum Voraussetzung für die Entwicklung von auf humanen neuralen Zellen basierenden In-vitro-Testsystemen, an Hand derer mögliche neurotoxische Effekte von therapeutischer Strahlung und Wirkstoffen vorhergesagt werden können, was für die Optimierung von Bestrahlungs-/Behandlungsplänen sowie für die Entwicklung neuer Medikamente von Relevanz sein kann.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Der Zusammenhang zwischen Strahlenexposition und der Beeinträchtigung der Hirnstruktur und -funktion ist für den Menschen aus epidemiologischen Studien umfangreich belegt. Dasselbe gilt für die Behandlung mit Chemotherapeutika: So zeigen beispielsweise Heranwachsende und Erwachsene, die vor dem 11. Lebensjahr aufgrund einer Leukämie eine Chemotherapie durchlaufen hatten, Veränderungen ihrer Hirnmorphologie und Hirnleistung, insbesondere ein kleineres Volumen der neokortikalen und subkortikalen grauen Hirnsubstanz und eine geringere hippocampale Gedächtnisleistung. Strahlung bewirkt im ZNS neben der Schädigung von neuralen Stammzellen und einer verminderten Neurogenese/Regeneration auch Veränderungen in der neuralen Struktur und synaptischen Plastizität sowie Entzündungsreaktionen und oxidativen Stress. In Maus-Experimenten wurde zudem eine veränderte Regulation zahlreicher Signaltransduktionswege nach Bestrahlung gezeigt: Bestrahlung in geringen Dosen führte im Gehirn von Mäusen zu Veränderungen in wenigstens neun Signalwegen, die in alternden menschlichen Neuronen sowie in Neuronen von Alzheimer-Patienten in ähnlicher Weise verändert sind. Auch in vitro wurde die Wirkung ionisierender Strahlung auf neurale (Vorläufer)Zellen, vor allem für Strahlung geringer Dosis, untersucht. Dabei konnte beispielsweise gezeigt werden, dass eine Bestrahlung humaner neuraler Vorläuferzellen u. a. mit erheblichem oxidativem Stress verbunden war und zu deutlichen Veränderungen im Genexpressionsmuster und im Epigenom der bestrahlten neuronalen Vorläuferzellen führte.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Forschungsarbeiten zielen auf die Aufklärung von molekularen Veränderungen in humanen neuralen Zellen, die der neurotoxischen Wirkung von Strahlung und Chemotherapeutika zugrunde liegen, und erfordern daher die Nutzung humaner Zellen. Zwar haben tierexperimentelle Studien, die i. allg. an Nagern durchgeführt wurden, zur Aufklärung dosisabhängiger Wirkungen von Bestrahlung auf die Neurogenese und die zerebrale Funktion beigetragen, jedoch bestehen z. B. hinsichtlich der Neurogenese erhebliche Spezies-spezifische Unterschiede: beim Menschen erfolgen beispielsweise wichtige Differenzierungs- und Reifungsschritte pränatal im letzten Trimester der fötalen Entwicklung, in Nagetieren hingegen postnatal. Zudem unterscheidet sich insbesondere der Neokortex des Menschen maßgeblich von jenem anderer Spezies in Größe, Struktur und Komplexität, wozu zumindest teilweise erhebliche Unterschiede in der Expansion spezifischer neuraler Vorläuferzellpopulationen beitragen, die selbst zwischen verschiedenen Primaten-Spezies stark ausgeprägt sind.

Die Erreichung der Forschungsziele erfordert ferner die Nutzung pluripotenter humaner Stammzellen. Primäres Hirngewebe zur Gewinnung adulter neuraler Stammzellen (beispielsweise aus Autopsien) steht in der für die Klärung der Forschungsfragen benötigten Menge und erforderlichen reproduzierbaren Qualität nicht zur Verfügung. Dies wäre aber die Voraussetzung für die in Blick genommene Entwicklung eines In-vitro-Systems, das für die Testung der toxischen Wirkung von Strahlung/Pharmaka eingesetzt werden soll; die Reproduzierbarkeit der experimentellen Bedingungen (und folglich des eingesetzten Mate­rials) ist hierfür essentiell. Primäres Hirngewebe aus abgetriebenen Föten ist ebenfalls lediglich sporadisch, nicht in den für die Durchführung des Forschungsvorhabens erforderlichen Mengen und nicht in ausreichend reproduzierbarer Qualität ver­fügbar. Die Eignung der genannten Zelltypen als Ausgangsmaterial zur Herstellung der für die Projektdurchführung erforderlichen ZNS-Zellen sowie für die Etablierung von Gehirn-Organoiden, wie sie aus pluripotenten Stammzellen abgeleitet werden können, ist derzeit nicht belegt. Aus letzterem Grund können auch immortalisierte neurale oder neuronale Zell-Linien nicht zur Erreichung der For­schungsziele verwendet werden.

Die Forschungsziele können voraussichtlich auch nicht unter Verwendung humaner indu­zierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) erreicht werden. Von erheblichem Belang hierfür ist, dass offenbar starke Unterschiede in der Strahlenresistenz von hES- und hiPS-Zellen bestehen. Diese gehen mit Unterschieden in der Expression von Genen einher, die für DNA-Reparaturenzyme codieren und in Folge einer strahlungsbedingten Schädigung der DNA aktiviert werden. Es ist derzeit nicht bekannt, ob diese Unterschiede nach Differenzierung in neurale oder sonstige Zellen fortbestehen. Eine nach Möglichkeit authentische Reaktion der Zellen auf Strahlenschädigung ist aber Voraussetzung für die Bestimmung der molekularen Grundlagen von Strahlenschäden. Die Nutzung von hiPS-Zellen wäre zudem mit weiteren Unwägbarkeiten wie der hohen Variabilität im (neuralen) Differenzierungspotential  verschiedener hiPS-Zell-Linien verbunden, die in der Literatur gut belegt sind und die verschiedene Ursachen haben können. So gibt es hinsichtlich der neuronalen Differenzierung von hiPS-Zellen deutliche Hinweise auf die Relevanz eines epigenetischen Gedächtnisses. Die genannten Tatsachen machen es nach derzeitigem Kenntnisstand erforderlich, die Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen durchzuführen.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 02.04.2020
Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Verwendung von hES-Zellen zur Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten sollen durch Kultivierung der Neurone bzw. zerebralen Organoide mit Tumorzellen und durch Vaskularisierung der Organoide stärker realistische Modelle für die Bewertung von Strahlenschäden auf humane neurale Zellen etabliert werden. Hierfür sollen zum einen aus hES-Zellen abgeleitete zerebrale Organoide mit primären Tumorzellen kokultiviert und die Neurone nach Bestrahlung bzw. Behandlung mit Zytostatika bezüglich möglicher Schäden analysiert werden. Zum anderen sollen die Organoide mit Perizyten und Endothelzellen kokultiviert und so eine Vaskularisierung angeregt oder aber eine Vaskularisierung innerhalb des Organoids durch Induktion der Differenzierung von vaskulären Zellen aus hES-Zellen erreicht werden. Auch in diesen Organoiden sollen mögliche toxische Effekte von Strahlung/Zytostatika auf die Neurone ermittelt werden.
Ferner sollen auch Tumormodelle durch gezielte Überexpression spezifischer Onkogene (bzw. durch Hemmung der Expression von Tumorsuppressor-Genen) in den Zellen zerebraler Organoide induziert und anschließend für die Untersuchung möglicher schädigender Wirkungen von Strahlung/Zytostatika auf neurale Zellen genutzt werden. Dabei soll auch bestimmt werden, ob und inwieweit die jeweiligen Tumore für Strahlung/Zytostatika empfindlich sind und auf welche Weise sie nach Bestrahlung/Zytostatika-Behandlung ggf. die sie umgebenden Nervenzellen beeinflussen.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Gegenstand der Forschungsarbeiten bleibt die Untersuchung des Auftretens und der Ursachen möglicher strahleninduzierter Schädigungen des Nervensystems, die ein maßgebliches Problem des Einsatzes ionisierender Strahlung zur Therapie von Patienten mit Hirntumoren darstellen. Während die zuvor genehmigten Arbeiten Untersuchungen an Populationen spezifischer Neurone bzw. an zerebralen Organoiden vorsehen (siehe 3.), sollen im Rahmen der nunmehr bewilligten Forschungsarbeiten zur Klärung der gleichen Forschungsfrage Zellmodelle zum Einsatz kommen, in denen sich humane Neurone in unmittelbarer Nachbarschaft von Tumorzellen befinden. Dadurch können insbesondere von Tumorzellen verursachte Effekte (z. B. die Wirkung sekretierter oder von infolge von Bestrahlung freigesetzten Faktoren) in die Untersuchungen einbezogen und so der Einfluss der Tumorzellen auf die Entstehung möglicher toxischer (Neben)Effekte einer Bestrahlung/Zytostatika-Behandlung bestimmt werden, die in reiner Neuronen-Kultur ggf. nicht erfasst werden können. Insofern haben derartige Ko-Kulturmodelle, die erst in jüngerer Zeit in der wissenschaftlichen Literatur veröffentlicht wurden, ggf. eine höhere Aussagekraft als die bislang für die Klärung der zentralen Forschungsfrage des Projektes vorgesehenen humanen Zellmodelle. Da die einer potentiellen Strahlenschädigung zugrundeliegenden molekularen Ereignisse (beispielsweise chromosomale Veränderungen, Veränderungen in der Expression spezifischer Gene, Ver¬änderungen in den elektrophysiologischen Eigenschaften bestimmter Neurone) nunmehr auch unter dem Einfluss eines experimentell erzeugten Tumorgeschehens analysiert werden, können neue und wesentliche Erkenntnisse über die Wechselbeziehung von Nerven- und Tumorzellen bei der Therapie mit Strahlung bzw. Zytostatika entstehen. Durch Nutzung unterschiedlicher Tumorzell-Linien bzw. durch Erzeugung von mit spezifischen Mutationen assoziierten Hirntumoren im Zellkulturmodell können sich ggf. auch Erkenntnisse über die Sensitivität verschiedener in einer humanen neuralen Nische befindlicher Tumore gegenüber Strahlung bzw. Zytostatika sowie über die molekularen Veränderungen in benachbarten Nervenzellen ergeben, die einer zur Zerstörung der Tumorzellen erforderlichen Strahlungs- bzw. Zytostatika-Dosis ausgesetzt sind.

Vorklärung der Forschungsfragen sowie Notwendigkeit der Verwendung von hES-Zellen für die mit dem Forschungsvorhaben verfolgten Zielstellungen.

Die grundsätzliche Fragestellung des Forschungsprojektes, nämlich die Klärung des Effektes von ionisierender Strahlung bzw. von Zytostatika auf humane Neurone, bleibt unverändert. Darlegungen zur Vorklärung dieser Fragestellung wurden bereits im ursprünglichen Antragsverfahren erbracht und als hinreichend bewertet (siehe 5.). Die nunmehr erforderlichen ergänzenden Darlegungen beziehen sich insbesondere auf die Frage nach den Voraussetzungen für die zur Nutzung vorgesehenen Ko-Kulturmodelle unter Verwendung humaner pluripotenter Stammzellen. Sowohl Ko-Kulturmodelle, die aus hES-Zell-abgeleiteten zerebralen Organoiden und primären Tumorzellen bzw. Tumorzell-Linien bestehen, als auch Ko-Kulturmodelle, die durch In-vitro-Transformation humaner Neurone erzeugt wurden, wurden bereits in der wissenschaftlichen Literatur publiziert, und die entsprechenden Vorgehensweisen für ihre Erzeugung sollen im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten zum Einsatz kommen.
Die Notwendigkeit, hES-Zellen für die Gewinnung der für das Forschungsvorhaben benötigten neuralen Zellen/zerebralen Organoide zu verwenden, wurde bereits im ursprünglichen Antragsverfahren geprüft (siehe 5.). Hinsichtlich einer denkbaren Nutzung von hiPS-Zellen anstelle von hES-Zellen wurde erneut darauf hingewiesen, dass sich hiPS-Zellen und hES-Zellen bekanntermaßen bezüglich ihrer Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung erheblich unterscheiden, wofür weiterhin verschiedene mögliche Ursachen diskutiert werden. Zudem ist es auch für die Herstellung transformierter Neurone durch Einsatz spezifischer Onkogene oder durch die Erzeugung bestimmter tumorassoziierter Mutationen erforderlich, ein in seinem Genom und Epigenom möglichst ursprüngliches Zellmaterial zu verwenden, das infolge von Alterung des Ausgangsmaterials, von Reprogrammierung und/oder von langandauernder Kultivierung keine zusätzlichen genetischen und epigenetischen Veränderungen erworben hat, wie sie für hiPS-Zellen immer wieder berichtet wurden.

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