120. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Max-Delbrück-Zentrum für Molekulare Medizin (MDC), Berlin

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt auch für die Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Die genehmigten Forschungsarbeiten lassen sich in zwei Projektteile untergliedern.

Gegenstand des ersten Projektteils ist die Untersuchung der molekularen Grundlagen der Differenzierung des menschlichen Rückenmarks aus neuromesodermalen Vorläuferzellen (neural-mesodermal progenitors, NMP-Zellen). Dabei soll insbesondere die Rolle des Wnt-Signalweges und daran beteiligter Faktoren für die Identität und für die Differenzierungsentscheidungen hES-Zell-abgeleiteter NMP-Zellen untersucht werden. Hierfür soll in hES-Zell-abgeleiteten Reporterzellen, die die Aktivierung des Wnt-Signalweges anzeigen, ein funktioneller knock out von Genen für bestimmte Transkriptionsfaktoren erfolgen, deren Genprodukte (mutmaßlich) in die Aufrechterhaltung der NMP-Zell-Population und deren Differenzierungsentscheidungen involviert sind. Nach Differenzierung in  NMP-Zellen soll deren weitere Entwicklung in Abhängigkeit von der Aktivität des Wnt-Signalweges analysiert und die molekularen Grundlagen von Differenzierungsentscheidungen durch Analyse der jeweiligen Transkriptome bestimmt werden. Ferner soll ein In-vitro-Modell für die frühe Rückenmarkentwicklung beim Menschen etabliert werden. Hierfür sollen auf der Grundlage von hES-Zellen Reporterzell-Linien hergestellt werden, anhand derer die Entwicklung von NMP-Zellen in die neurale bzw. mesodermale Linie verfolgt werden kann. Diese Zellen sollen dann in eine geeignete Matrix eingebracht, dadurch die Selbstorganisation der NMP-Zellen zu einem (frühen) Rückenmark-Organoid angestoßen und die Bedingungen der Organoidbildung schließlich optimiert werden.

In einem zweiten Projektteil sollen die Bedingungen untersucht und optimiert werden, unter denen sich NMP-Zellen zu spinalen Motoneuronen unterschiedlicher Identität entwickeln können. Hierbei soll u. a. evaluiert werden, ob eine Überexpression verschiedener HOX-Gene in hES-Zell-abgeleiteten NMP-Zellen eine Differenzierung zu brachialen, thorakalen oder lumbalen Motoneuronen begünstigen kann. Zu diesem Zweck sollen entsprechend transgene hES-Zellen generiert, in Motoneuronen differenziert und diese hinsichtlich ihres Phänotyps umfassend mit dem Ziel der Identifizierung jener Signalwege charakterisiert werden, die eine Modulation der Differenzierung in spezifische Typen von Motoneuronen erlauben. Desweiteren soll die Rolle von BRACHYURY bei der Differenzierung von NMP-Zellen in Motoneurone näher bestimmt werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn für die Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten sollen Fragen nach den molekularen Eigenschaften neuromesodermaler Vorläuferzellen (NMP-Zellen) geklärt werden. Dieser Zelltyp hat eine maßgebliche Funktion bei der fortschreitenden Verlängerung der Längsachse des Embryos bei gleichzeitiger und koordinierter Differenzierung in neurale und mesodermale Zellen; allerdings ist derzeit nicht geklärt, auf welchem Wege die Population der NMP-Zellen während der frühen Phase der Embryonalentwicklung aufrechterhalten wird und welche Signale ihre Differenzierung in mesodermale bzw. neuroektodermale Zellen anstößt. Zudem ist die Identität dieser Zellen nicht endgültig geklärt. Die Forschungsarbeiten zielen daher darauf, Erkenntnisse über die molekularen Eigenschaften sowie über die Grundlagen von Differenzierungsentscheidungen von humanen NMP-Zellen zu gewinnen, die individuelle Rolle bestimmter Transkriptionsfaktoren für die Selbsterneuerung bzw. für Differenzierungsentscheidungen von NMP-Zellen zu bestimmen und ggf. spezifische Signalkaskaden zu identifizieren, die für die weitere Entwicklung von NMP-Zellen maßgeblich sind. Legt man die offenbar große Bedeutung des NMP-Zell-Pools zugrunde, können die hier angestrebten Erkenntnisse ggf. erheblich zum Verständnis früher Prozesse der menschlichen Embryonalentwicklung auf zellulärer Ebene beitragen.

Ferner sollen NMP-Zellen zur Etablierung eines dreidimensionalen Modells für die frühe Entwicklung des menschlichen Rückenmarks genutzt werden. Dabei sollen die Bedingungen für die Bildung der entsprechenden dreidimensionalen Zellaggregate für ein „Schwanzknospen“-Modell optimiert, die Selbstorganisation der NMP-Zellen zu 3D-Aggregaten und die Ausbildung einer anterioren-posterioren Achse über einen längeren Zeitraum beobachtet sowie die sich aus NMP-Zellen entwickelnden Zelltypen in verschiedenen Regionen des Organoids und zu verschiedenen Zeitpunkten von dessen Entwicklung charakterisiert werden. Auf diesem Wege sollen Erkenntnisse über die räumliche Organisation und Migration der Zellen, ihre Wechselwirkungen im Organoid, ihre Spezifizierung zu bestimmten Zelltypen sowie über die zeitliche Abfolge von Prozessen der frühen Organoidbildung erlangt werden. Das Modell kann ggf. dazu beitragen, frühe Prozesse insbesondere der Entwicklung posteriorer Strukturen im frühen menschlichen Embryo (Schwanzknospenbildung) nachzubilden, die extrinsischen Voraussetzungen für diese Differenzierungsprozesse zu bestimmen und dadurch Erkenntnisse mit Relevanz für entwicklungsbiologische Fragestellungen zu gewinnen.

Weiterhin sollen Prozesse der Diversifizierung menschlicher Motoneurone untersucht und die Vorgehensweisen für eine effiziente In-vitro-Differenzierung von pluripotenten Stammzellen des Menschen in spezifische Typen von Motoneuronen etabliert werden. Herkömmliche Vorgehensweisen zur Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Motoneuronen sind relativ langwierig und führen vorwiegend zu Motoneuronen zervikaler und brachialer Identität. Die biologischen Mechanismen der Entwicklung verschiedener Subtypen von Motoneuronen sind für den Menschen bislang nur unvollständig verstanden. Differenzierungsprotokolle, die zu Motoneuronen einer positionsspezifischen Identität (zervikal, brachial, thorakal, lumbal) führen, sind gegenwärtig nicht verfügbar. Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten sollen u. a. Moleküle und Signalwege identifiziert werden, die in Prozesse der Motoneuron-Spezifizierung involviert sind und dadurch Einblicke in extrinsische Signale, Transkriptionsprogramme und interzelluläre bzw. parakrine Kommunikationswege gewonnen werden, die für die Entwicklung spezifischer Typen von Motoneuronen von Bedeutung sind. Dies kann zu neuen Erkenntnissen über frühe neurale Entwicklungsprozesse während der menschlichen Embryogenese sowie ggf. zur Etablierung verbesserter Protokolle für die In-vitro-Differenzierung von pluripotenten Stammzellen des Menschen in Motoneurone führen, beispielsweise infolge der geplanten Analyse der molekularen Konsequenzen einer ektopischen Überexpression verschiedener Hox-Gene in sich differenzierenden NMP-Zellen. Angesichts der Tatsache, dass zahlreiche degenerative Erkrankungen des Nervensystems durch den Verlust der Funktion von Motoneuronen bedingst sind, können die angestrebten Resultate mittelfristig auch von medizinischer Relevanz sein.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Die Existenz bipotenter NMP-Zellen, die sowohl in posteriores Neuroektoderm als auch in paraxiales Mesoderm differenzieren können, ist für den frühen murinen Embryo in vivo umfangreich belegt. Die Herstellung von NMP-Zellen ist sowohl unter Nutzung muriner ES-Zellen als auch auf der Grundlage humaner ES-Zellen gelungen. Die Analyse des Transkriptoms muriner NMP-Zellen führte zudem zur Identifizierung von ca. 240 Genen, die in NMP-Zellen verstärkt exprimiert werden, deren spezifische Rolle für die Identität, Aufrechterhaltung und Differenzierung humaner NMP-Zellen nunmehr geklärt werden soll. In diesem Zusammenhang liegen aus dem Maus-System u. a. bereits starke Anhaltspunkte für eine entscheidende Rolle des Wnt-Signalweges für die Proliferation und Selbsterneuerung der murinen NMP-Zell-Population vor. Hinsichtlich der Etablierung von Modellen für die frühe Rückenmarkentwicklung wurde, unter Nutzung muriner ES-Zellen, ein 3D-Modell etabliert, in dem die instruierende Wirkung der wnt/FGF-Signalkaskaden auf die Entstehung einer NMP-Zell-Population unter dreidimensionalen Bedingungen nachgewiesen und die Bedingungen für die Expansion des Aggregates untersucht wurden. Protokolle für die Differenzierung von (murinen und humanen) embryonalen Stammzellen zu Motoneuronen wurden in der Vergangenheit etabliert. Die Rolle von Produkten der HOX-Gene für die Segmentierung des sich entwickelnden Embryos sowie die Expression verschiedener HOX-Gene in bestimmten Subtypen von Motoneuronen sind gut etabliert.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Erreichung der Forschungsziele erfordert die Verwendung menschlicher Zellen. Grundprinzipien der Organogenese und Embryonalentwicklung sind zwar innerhalb verschiedener Säuger-Spezies konserviert; Gegenstand des Forschungsvorhabens ist aber die Charakterisierung humaner NMP-Zellen gerade auch hinsichtlich möglicher Unterschiede zu den bislang sehr viel umfangreicher charakterisierten NMP-Zellen murinen Ursprungs. Aufgrund des sehr schmalen Zeitfensters, während dessen Differenzierungsentscheidungen im sich entwickelnden Embryo durch bestimmte Moleküle angestoßen werden, sind ‒ angesichts der sehr unterschiedlichen Kinetik der Embryonalentwicklung in verschiedenen Spezies ‒ Unterschiede auch zwischen den aus embryonalen Stammzellen abgeleiteten NMP-Zellen zu erwarten. Die Forschungsziele können auch nicht unter Nutzung anderer als pluripotenter Stammzellen des Menschen erreicht werden, da hier ein Zellmodell zur Untersuchung früher Prozesse der menschlichen Embryogenese benötigt wird. Alle anderen denkbaren humanen Zelltypen (adulte und fötale Stammzellen, primäre Zellen, immortalisierte Zellen) haben aber das hier relevante (frühembryonale) Entwicklungsstadium bereits durchschritten.

Nach gegenwärtigem Kenntnisstand liegen auch keine ausreichenden Hinweise darauf vor, dass sich die Forschungsziele unter Nutzung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) erreichen ließen. Zum einen liegen derzeit keine Studien vor, nach denen eine Herstellung von NMP-Zellen aus hiPS-Zellen erfolgreich durchgeführt wurde. Zum anderen sollen im Rahmen der beantragten Forschungsarbeiten Prozesse der frühen Embryogenese anhand eines möglichst gut geeigneten Zellmodells aufgeklärt werden. Für ein solches Zellmodell sind aber nach derzeitigem Kenntnisstand hES-Zellen, die aus einem frühen menschlichen Embryo stammen, besser geeignet als hiPS-Zellen, die durch Reprogrammierung aus somatischen Zellen gewonnen werden. Bei hiPS-Zellen besteht eine erhebliche Variabilität im Differenzierungspotential, die ggf. auf genetische Unterschiede zwischen den Spendern der somatischen Ausgangszellen oder auf eine unvollständige Reprogrammierung zurückgeführt werden können. Zudem stellt die reprogrammierungsbedingte De-novo-Mutagenese ein in hiPS-Zellen beobachtetes Phänomen dar, dessen Konsequenzen für die Nutzbarkeit der jeweiligen hiPS-Zell-Linie nicht vorhergesagt werden können.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 11.05.2021

Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist es, die Rolle verschiedener HOX-Gene für die Entwicklung positionsspezifischer Motoneuronen im Detail zu untersuchen. Hierfür sollen zum einen Reportergene in die Loci verschiedener HOX-Gene eingebracht werden, deren Expression in sich differenzierenden Neuronen mit verschiedenen Identitäten von Motoneuronen assoziiert ist, zum anderen sollen die entsprechenden HOX-Gene überexprimiert und damit die Differenzierung von Motoneuronen spezifischer Identitäten (cranial, zervikal, brachial, thorakal, lumbal und sakral) angestoßen bzw. verstärkt werden. Die genetisch veränderten Zellen sollen dann zur Bildung von positionsspezifischen Rückenmark-Organoiden genutzt werden, die hinsichtlich ihrer weiteren Entwicklung und der Aktivität der in ihnen aktiven Signalwege analysiert werden sollen.
Ferner soll untersucht werden, welchen Einfluss eine Vaskularisierung bzw. die Präsenz endothelialer Zellen auf die Entwicklung und funktionale Reifung von Rückenmark-Organoiden hat. Hierfür sollen hES-Zellen mit einem Transgen versehen werden, dessen (Über)Expression die Entwicklung und Reifung endothelialer Zellen auslöst bzw. verstärkt. Die Bildung und funktionale Reifung hES-Zell-abgeleiteter Rückenmark-Organoide und neuromuskulärer Organoide soll dann in Anwesenheit endothelialer Zellen untersucht und der Einfluss von Endothelzellen beispielsweise auf die Modulation von intrazellulären Signalwegen bestimmt werden.
Schließlich sollen die Prozesse, die bei der Entwicklung der motorischen Endplatte (also des Kontaktes von Nerven- und Muskelzellen) ablaufen, näher untersucht werden. Auch hierfür sollen Reportergene in die Loci von Genen eingebracht werden, deren Produkte Komponenten der motorischen Endplatte sind. Die Reporter-Zellinien sollen dann für die detaillierte Untersuchung von Prozessen genutzt werden, die an der Ausbildung der motorischen Endplatte beteiligt sind.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Das Ziel der Forschungsarbeiten bleibt grundsätzlich unverändert. Es wird auch im Rahmen der nunmehr genehmigten Forschungsarbeiten ein verbessertes Verständnis der molekularen Grundlagen jener Prozesse angestrebt, die bei der Diversifizierung menschlicher Motoneurone ablaufen; zudem sollen auch weiterhin Vorgehensweisen für eine effiziente In-vitro-Differenzierung von pluripotenten Stammzellen des Menschen in spezifische Typen von Motoneuronen etabliert und optimiert werden. Die derzeit genutzten Protokolle zur Gewinnung von Motoneuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen sind nach wie vor langwierig und führen nur zur Entwicklung von Motoneuronen weniger positionsspezifischer Aktivitäten. Die molekularen und zellbiologischen Grundlagen der Entwicklung verschiedener Subtypen von Motoneuronen bedürfen weiterhin der Aufklärung und entsprechende Differenzierungsprotokolle müssen entwickelt und optimiert werden. Angesichts der Diversität innerhalb der Motoneurone und der Tatsache, dass bei bestimmten Motoneuronen-Erkrankungen nur spezifische Subtypen von Motoneuronen betroffen sind, wäre eine In-vitro-Verfügbarkeit spezifischer Subtypen von Motoneuronen wünschenswert, beispielsweise für die Entwicklung von Zellmodellen für das Verständnis entsprechender Erkrankungen oder für die Entwicklung von Wirkstoffen. Dies setzt aber eine Kenntnis über das Zusammenspiel von extrinsischen Faktoren, Signalkaskaden und Transkriptionsfaktoren bei der Diversifizierung von Motoneuronen voraus.

Ferner soll der Einfluss endothelialer Zellen auf die Reifung von Rückenmark-Organoiden untersucht werden. Bislang wurden NMP-Zellen für die Etablierung von Rückenmark-Organoiden genutzt, wobei Erkenntnisse über die räumliche Organisation und Migration der Zellen, ihre Wechselwirkungen im Organoid, ihre Spezifizierung zu bestimmten Zelltypen sowie über die zeitliche Abfolge von Prozessen der frühen Organoidbildung, beispielsweise mit Blick auf das Auftreten spezifischer Genexpressionsmuster, erlangt werden sollen. Diese Fragen sollen nun auch in Anwesenheit endothelialer Zellen untersucht werden, die durch Transkriptionsfaktor-induzierte Differenzierung aus hES-Zellen gewonnen werden. Erwartet werden Erkenntnisse über das Wechselspiel zwischen neuro-muskulärer und endothelialer Differenzierung bei der Entwicklung des menschlichen Rückenmarks. Durch die geplanten Untersuchungen zur Entwicklung der motorischen Platte im Rahmen sich entwickelnder Rückenmark-Organoide sollen die Lokalisation sowie der zeitliche Ablauf von Prozessen der Bildung motorischer Platten bestimmt werden. Zudem sollen Kenntnisse darüber erlangt werden, ob und inwieweit die Rückenmark-Organoide unter den jeweiligen Differenzierungsbedingungen funktional reifen und wie dieser Prozess durch Modulation der entsprechenden Genexpression und der Signalwege beeinflusst werden kann.

Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Zur Vorklärung von geeigneten Vorgehensweisen für die Differenzierung von hES-Zellen in NMP-Zellen, Rückenmark-Organoide und Motoneuronen wurde im ursprünglichen Antragsverfahren bereits umfänglich vorgetragen. Die an der Entwicklung von Motoneuronen beteiligten Genprodukte aus der HOX-Gen-Familie, die hier mit Reportergenen fusioniert bzw. induziert exprimiert werden sollen, sind bekannt, ihre Funktion in der Etablierung spezifischer Motoneurone ist aber nur unvollständig erforscht. Die konditionale Expression von Genen für entwicklungsspezifische Transkriptionsfaktoren ist eine in der Stammzellbiologie weitverbreitete Vorgehensweise, um Differenzierungsprozesse verstärken und spezifische Zellpopulation anreichern zu können. Methoden für die genetische Modifikation von hES-Zellen mittels CRISPR/Cas sind in der wissenschaftlichen Literatur mittlerweile vielfach beschrieben worden. Zur Rolle der hier in Blick genommenen Transkriptionsfaktoren bei der Entwicklung und Proliferation endothelialer Vorläuferzellen liegen entsprechende Studien aus der Maus vor. Die Entwicklung motorischer Endplatten aus humanen pluripotenten Stammzellen wurde ebenfalls bereits in der Literatur beschrieben.
Die Argumente, die im ursprünglichen Antragsverfahren sowie im Rahmen des Antragsverfahrens zur Begründung der Notwendigkeit der Verwendung von hES-Zellen vorgetragen wurden, gelten im wesentlichen unverändert fort. Humane Zellen sind erforderlich, da eine Übertragung von Ergebnissen aus dem Tiermodell auf den Menschen auf Grund von Unterschieden in der Differenzierung, beispielweise in Richtung von Motoneuronen, nicht ohne weiteres möglich ist. Zwar sind die im murinen System hierfür entwickelten Protokolle prinzipiell auf humane pluripotente Stammzellen übertragbar, jedoch ist die Differenzierung humaner ES-Zellen zu Motoneuronen deutlich weniger effektiv und langwieriger, und die Protokolle mussten für humane ES-Zellen angepasst und optimiert werden. Die Notwendigkeit der Nutzung pluripotenter Stammzellen ist weiterhin dadurch begründet, dass die hier ebenfalls interessierenden frühen Entwicklungsstadien von adulten und fötalen Stammzellen zumindest teilweise durchschritten wurden.

Nach gegenwärtigem Kenntnisstand liegen auch keine ausreichenden Hinweise darauf vor, dass sich die Forschungsziele unter Nutzung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) erreichen ließen. Die Tatsache, dass im Rahmen der Forschungsarbeiten Prozesse der frühen Embryogenese anhand eines möglichst gut geeigneten Zellmodells aufgeklärt werden sollen, ist unverändert. Auch nach derzeitigem Kenntnisstand sind hES-Zellen, die aus einem frühen menschlichen Embryo stammen, für ein solches Zellmodell aber grundsätzlich besser geeignet als durch Reprogrammierung aus somatischen Zellen gewonnene hiPS-Zellen. Neben der erheblichen Variabilität im Differenzierungspotential von hiPS-Zellen, die auf genetische Unterschiede zwischen den Spendern der somatischen Ausgangszellen oder auf eine unvollständige Reprogrammierung zurückgeführt werden können, kann die häufig beobachtete reprogrammierungsbedingte De-novo-Mutagenese in hiPS-Zellen nicht oder schwer vorhersagbare Konsequenzen für die Nutzbarkeit der jeweiligen hiPS-Zell-Linie für die hier interessierenden Forschungsfragen haben; zudem sind die Konsequenzen der gut dokumentierten epigenetischen Unterschiede zwischen hES- und hiPS-Zellen nach wie vor nicht geklärt.

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