111. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Herr Dr. Micha Drukker, Helmholtz Zentrum München

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H7 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA
• H13 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H14 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• I3 (Technion ‒ Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I4 (Technion ‒ Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I6 (Technion ‒ Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• HUES 6 (Harvard University, Cambridge, MA,USA)
• HUES 8 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES 9 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten ist die Untersuchung der Funktion bestimmter Chromatin-modifizierender Proteine, die mit Polycomb group (PcG)- und Trithorax group (TrxG)- Proteinen assoziiert sind, während früher Differenzierungsprozesse menschlicher Zellen. Dazu sollen die jeweiligen Gene in humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) sowohl mono- als auch biallelisch (konditionell) mutiert und die Folgen eines funktionellen knockout der verschiedenen Gene insbesondere auf die Differenzierung von hES-Zellen in neurale und kardiale Zellen sowie in mesenchymale Vorläuferzellen untersucht werden. Insbesondere durch vergleichende Untersuchungen der Expressionsprofile von sich differenzierenden (Wildtyp- und mutierten) hES-Zellen sollen ggf. weitere Gene identifiziert werden, deren Aktivität vermutlich durch Produkte der untersuchten Gene reguliert wird bzw. die mit  den von ihnen kodierten Proteinen in Wechselwirkung stehen. Derartige Gene sollen dann in hES-Zellen ebenfalls funktionell deletiert und der Einfluss auf die Differenzierung von hES-Zellen untersucht werden. Da Mutationen in den für das Forschungsprojekt ausgewählten PcG- und TrxG-assoziierten Genen teils mit schweren Entwicklungsstörungen in Zusammenhang stehen, soll die Rolle der entsprechenden Mutationen für die Ausprägung eines pathologischen Phänotyps bestimmt werden. In diesem Zusammenhang sollen humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) aus entsprechenden Patienten hergestellt und ggf. weitere Gene identifiziert werden, deren Mutation mutmaßlich zur Ausprägung des entsprechenden Krankheitsbildes beitragen. Derartige Kandidatengene sollen dann (gemeinsam mit den PcG- und TrxG-assoziierten Genen) in hES-Zellen funktionell deletiert und die Konsequenzen insbesondere für die Differenzierung der Zellen bestimmt werden. hES-Zellen werden hierbei auch als Referenzmaterial für die Charakterisierung von hiPS-Zellen verwendet.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen für die Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Die im Vorhaben zu untersuchenden Proteine sind an der durch PcG- und TrxG-Proteine vermittelten repressiven bzw. aktiven Chromatin-Konfiguration beteiligt und spielen bei der Regulation der Genexpression in Entwicklungsprozessen, aber auch bei der Aufrechterhaltung zellulärer Funktionen, eine offenbar erhebliche Rolle. Allerdings sind die spezifischen Funktionen dieser Proteine sowie die Konsequenzen ihres Funktionsverlustes insbesondere in frühen Entwicklungsprozessen bislang wenig verstanden. Vor dem Hintergrund zahlreicher offener Fragen soll im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten nun geklärt werden, welche konkreten Auswirkungen die funktionale Deletion der jeweiligen Gene auf die Pluripotenz humaner ES-Zellen hat und ob und in welcher Weise die Differenzierung von hES-Zellen in bestimmte Zelltypen durch den Verlust des jeweiligen Proteins beeinträchtigt wird. Hieraus sind ggf. Auskünfte darüber zu erwarten, ob die Produkte der betreffenden Gene für die Aufrechterhaltung von Pluripotenz in vitro erforderlich sind und welche der hier untersuchten Genprodukte in welche (frühen) Differenzierungsprozesse involviert sind. Insgesamt wird ein besseres Verständnis als bislang über die Rolle von Modifikatoren des Epigenoms für Pluripotenz und Differenzierung erwartet.

Die Forschungsarbeiten erfolgen auch vor dem Hintergrund, dass Mutationen in den hier interessierenden PcG- und TrxG-assoziierten Genen mit zahlreichen Erkrankungen des Menschen in Zusammenhang stehen und beispielsweise mit komplexen und schwerwiegenden Entwicklungsstörungen beim Menschen assoziiert sein können. Zudem sind Mutationen in diesen PcG-und TrxG-assoziierten Genen häufig mit malignen Erkrankungen insbesondere des Blutsystems assoziiert. Das im Ergebnis des Forschungsvorhabens erwartete tiefere Verständnis über die Funktionen dieser Gene während der Entwicklung und Differenzierung kann somit ggf. auch dazu beitragen, die molekularen Ursachen assoziierter Erkrankungen besser als bislang zu verstehen. Neben Erkenntnissen über spezifische Funktionen der von diesen Genen kodierten Proteine für die Entwicklung und Funktion bestimmter Zelltypen sowie über die Konsequenzen ihrer funktionalen Deletion für molekulare Pathogenese-Prozesse könnten zudem Kofaktoren der Proteine identifiziert werden, die für Prozesse relevant sind, die bei der Entstehung und beim Voranschreiten von assoziierten Erkrankungen auftreten.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Zur Frage möglicher Funktionen der Produkte der betreffenden PcG- und TrxG-assoziierten Gene während der Entwicklung wurden in den vergangenen Jahren zahlreiche Studien veröffentlicht, die im wesentlichen auf der Nutzung entsprechender knockout-Mäuse basieren. So führt ein homozygoter knockout eines der im Vorhaben zu untersuchenden Gene zu hoher embryonaler Letalität, lebend geborene Mäusen weisen u. a. ein geringeres Gewicht als Wildtyp-Mäuse sowie Splenomegalie auf. Heterozygote Tiere dieser knockout-Mauslinie zeigen sehr häufig eine frühe postmortale Letalität, darüber hinaus u. a. Deformationen der Wirbelsäule sowie Entwicklungsstörungen im hämatopoetischen System. Ferner weisen solche knockout-Mäuse teils starke Veränderungen im kardialen Phänotyp auf. Kürzlich wurden in einem weiteren knockout-Stamm, in dem das gleiche Gen ausgeschaltet war, Beeinträchtigungen der Nierenentwicklung im Fötalstadium beschrieben, die auf Defizite in der Differenzierung von Podozyten zurückzuführen waren. Ein biallelischer knockout eines anderen der Gene, die in dem Vorhaben untersucht werden sollen, ist ebenfalls mit erheblicher pränataler Mortalität verbunden; geborene Mäuse sind teils zwergwüchsig und kurzlebig. Homozygote Tiere dieser knockout-Mauslinie, die das fortpflanzungsfähige Alter erreichten, weisen teils Missbildungen im Skelett auf, haben ein geringeres Gewicht als Wildtyp-Mäuse und zeigen eine Vergrößerung des Herzens, die histologisch mit einer anomalen Myozyten-Organisation im Gewebe sowie interstitialer Fibrose einhergehen.

Für den Menschen liegen Hinweise auf mögliche Funktionen der im Vorhaben zu untersuchenden Gene bislang vor allem aus den klinischen Merkmalen von Erkrankungen vor, die mit einem Funktionsverlust dieser Gene verbunden sind. Die im Forschungsvorhaben zur Anwendung kommenden Techniken, beginnend bei der genetischen Veränderung von hES-Zellen unter Nutzung des CRISPR/Cas-Systems, über die Differenzierung von hES-Zellen in neurale und kardiale Zellen sowie in mesenchymale Vorläuferzellen bis hin zu den vorgesehenen Methoden für die Analyse von Transkriptomen und Epigenomen sind in der wissenschaftlichen Literatur vielfach beschrieben worden und gut etabliert.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Trotz der Tatsache, dass Mausmodelle einen nicht unerheblichen Erkenntnisgewinn zur Funktion der im Fokus der Untersuchung stehenden Genprodukte erbracht haben, bestehen gut dokumentierte Unterschiede in den Folgen eines funktionellen knockout der jeweiligen PcG- und TrxG-assoziierten Gene in Maus und Mensch. Insofern kann nicht davon ausgegangen werden, dass Forschungsergebnisse aus dem Mausmodell oder aus Zellen der Maus ohne weiteres vollständig die Situation im Menschen widergeben. Die angestrebten Erkenntnisse über die Rolle der PcG- und TrxG-assoziierten Proteinen in der (frühen) Entwicklung menschlicher Zellen erfordert die Nutzung humanen Materials. Die Forschungsziele können aller Voraussicht nach auch nicht unter Nutzung anderer humaner Zellen als pluripotenter Stammzellen erreicht werden. Ziel der Forschungsarbeiten ist ein Erkenntnisgewinn über die Rolle von bestimmten PcG- und TrxG-assoziierten Proteinen (sowie von diesen regulierten Faktoren) in frühen menschlichen Differenzierungsprozessen. Da andere mögliche humane Zelltypen wie primäre Zellen oder somatische und fötale Stammzellen diese Differenzierungsprozesse bereits durchschritten haben, können sie hier nicht verwendet werden. Für andere denkbare humane Zellquellen wie beispielsweise immortalisierte Zellen oder Tumorzell-Linien trifft dies ebenfalls zu; überdies sind diese nicht in zu pluripotenten Stammzellen vergleichbarer Weise in die gewünschten Zelltypen differenzierbar. Die Erreichung der Forschungsziele erfordert daher die Verwendung humaner pluripotenter Stammzellen.

Die Forschungsziele können voraussichtlich auch nicht unter alleiniger Nutzung von hiPS-Zellen erreicht werden. Primäres Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist es, den Effekt von verschiedenen definierten Mutationen in den ausgewählten PcG- und TrxG-assoziierten Genen auf den Phänotyp pluripotenter und sich differenzierender menschlicher Zellen zu bestimmen. Um den Effekt einer singulären genetischen Veränderung analysieren zu können, sind jedoch Zellen erforderlich, die möglichst ursprüngliche Eigenschaften haben und keine zusätzlichen Mutationen aufweisen, die ggf. den interessierenden Phänotyp beeinflussen. Zudem müssen die Zellen ein möglichst ursprüngliches und für pluripotente Stammzellen des Menschen typisches Epigenom aufweisen, da in den genehmigten Forschungsarbeiten Faktoren untersucht werden sollen, die an der Regulation von Differenzierungs- und Entwicklungsvorgängen über die Modulation epigenetischer Eigenschaften der Zellen beteiligt sind. Beide Voraussetzungen erfüllen hiPS-Zellen nicht in gleichem Maße wie hES-Zellen. Zum einen werden hiPS-Zellen aus somatischen Zellen hergestellt, die ggf. bereits eine erhebliche Anzahl von genetischen Veränderungen durchlaufen haben, deren Einfluss auf frühe Differenzierungsprozesse nur schwer abgeschätzt werden können. Zum anderen bestehen bezüglich des Epigenoms von hiPS-Zellen Unterschiede zu hES-Zellen, beispielsweise in reproduzierbaren und typischen Differenzen in der DNA-Methylierung. Ferner liegen starke Hinweise auf ein epigenetisches Gedächtnis von hiPS-Zellen vor, in dem bestimmte Eigenschaften des Epigenoms des zur Reprogrammierung genutzten Zelltyps konserviert sind.

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