106. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber

Herr Prof. Dr. Christian Rosenmund, Charité – Universitätsmedizin Berlin

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linie:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist die Nutzung eines auf hES-Zellen basierenden In-vitro-Modells für neuronale Zellen, an dem die Konsequenzen eines funktionellen knock out des Gens für Synapsin-1 (SYN1) für die synap­ti­sche Aktivität auf ultra­struk­tu­rel­ler Ebene bestimmt werden soll. hES-Zell-Linien, in denen ein konditionaler knock out des SYN1-Gens erfolgte, wurden bereits außer­halb Deutsch­lands erzeugt, in Neuronen differenziert und diese elektro­phy­si­o­lo­gisch bereits bezüglich bestimmter Aspekte ihrer synaptischen Aktivität unter­sucht. Im Rahmen der genehmigten Arbeiten sollen nun Wildtyp- und im SYN1-Gen mu­tier­te hES-Zel­len – nach Transfer eines Gens für Kanal-Rho­dop­sin – ebenfalls in Neurone differenziert, die Zellen optisch ultra­struk­turel­ler aktiviert und zu ver­schie­de­nen Zeitpunkten kurz nach der Aktivierung vitrifiziert werden, wobei die beim Genehmigungsinhaber etablierte flash and freeze-Methode zum Einsatz kommen soll. Anschließend sollen die Synapsen elek­tro­nen­mi­kros­ko­pisch insbesondere hinsichtlich Größe, Ultrastruktur sowie Zahl und Verteilung von synaptischen Vesikeln charakterisiert werden. Ferner soll mit diesem Modell der Einfluss ausgewählter Pharmaka auf die Struktur und Aktivität der Synapsen bestimmt werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich be­grün­de­ten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kom­mis­sion für Stammzellenforschung und des Robert Koch-Institutes (RKI) vorrangig hoch­ran­gi­gen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Er­kennt­nis­ge­winn für die Grund­la­gen­for­schung. Für diese Beurteilung sind die folgenden Gründe maßgeblich:

Die genehmigten Forschungsarbeiten zielen auf die Gewinnung neuer Er­kennt­nis­se über die Regulation von synaptischer Aktivität und deren Störung. Zum einen sollen mittels des flash and freeze-Verfahrens und der dadurch möglichen zeit­lich hoch­auf­lö­sen­den elektronenmikroskopischen Analyse der Ultrastruktur von Sy­nap­sen Einblicke in die aktivitätsabhängigen Veränderungen in der subzellulären Struktur der Synapsen von humanen neuronalen Zellen ge­won­nen werden. Zum anderen sollen die möglicherweise veränderten Ei­gen­schaf­ten von Synapsen infolge eines Defektes im SYN1-Gen bestimmt werden, was ggf. Rückschlüsse auf pathologische Veränderungen zulassen kann, die auf sub­zel­lu­lä­rer Ebene bei der durch diesen genetischen Defekt bedingten Erkrankungen auftreten.

Bereits die im Forschungsvorhaben vorgesehenen Untersuchungen unter Nutzung von aus Wildtyp-hES-Zellen gewonnenen Neuronen sind angesichts zahlreicher offener Fragen bezüglich der Funktion menschlicher Synapsen, beispielsweise zur Zusammensetzung des synaptischen Vesikel-Pools oder zu den spezifischen Charakteristika seiner Subfraktionen, von erheblicher Relevanz und können vor­aus­sicht­lich zu neuen Erkenntnissen über die Ei­gen­schaf­ten synaptischer Vesikel und über den Zusammenhang zwischen der Depolarisation menschlicher Neurone und der Reorganisation der synaptischen Vesikel beitragen. Sie können auch zu einem vertieften Verständnis darüber führen, wie der Zyklus von Fusion und Neu­bil­dung von Vesikeln in zeitlicher Hinsicht abläuft, neue Einblicke in die Lo­ka­li­sa­tion der Vesikel in den Axon­ter­mi­na­len von humanen Nervenzellen geben und zur Klärung der Frage nach der Art und Weise des Transportes synaptischer Vesikel beitragen.

Im Rahmen der Forschungsarbeiten, die unter Verwendung hES-Zell-ab­ge­lei­te­ter SYN1-defizienter Neurone erfolgen, sollen ferner die Rolle von SYN1 in humanen Neuronen und die Konsequenzen seines funktionellen knock out auf ultra­struk­tu­rel­ler Ebene untersucht werden. Dabei soll vor allem die Hypothese überprüft werden, dass die infolge der SYN1-Defizienz ggf. veränderten sy­nap­ti­schen Eigenschaften mit Veränderungen in der Gesamtzahl der synaptischen Vesikel sowie der Anzahl der mit der Plasmamembran fusionierten Vesikel in Zu­sam­men­hang stehen. Dies kann mit der gewählten Methode in hoher zeitlicher Auflösung untersucht werden und führt voraussichtlich zu neuen, wesentlichen Erkennt­nis­sen über Veränderungen in Anzahl, Struktur und Lokalisation von synaptischen Vesikeln, die in den Axonen SYN1-defizienter Zellen zu ver­schie­de­nen Zeit­punk­ten nach Aktivierung auftreten. Dies ist angesichts der Tatsache, dass ein funktioneller Verlust von SYN1 offenbar mit einigen neurologischen Erkrankungen wie bei­spiels­wei­se bestimmten Formen von Epilepsie sowie von Autismus in Zusammenhang stehen kann, auch von medi­zi­ni­scher Relevanz. Mögliche Defizite, die bei den o.g. komplexen Erkrankungen auf ultra­struk­tu­rel­ler Ebene bestehen, könnten identifiziert und auf diesem Wege zum Verständnis der molekularen Grundlagen der genannten Erkrankungen beigetragen werden.

Ferner soll überprüft werden, ob und inwieweit die Präsenz bestimmter pharma­ko­lo­gisch wirksamer Substanzen die Ultrastruktur der Synapsen SYN1-de­fi­zi­en­ter hu­ma­ner neuraler Zellen verändern kann. Es wurde bereits gezeigt, dass SYN1-De­fi­zienz in humanen Neuronen offenbar zu einer Resistenz gegenüber bestimmten Pharmaka führt, deren Präsenz die synaptische Aktivität in Wildtyp-Neuronen hemmt. Die vor­ge­se­he­nen Untersuchungen sollen nun zur Klärung der Frage beitragen, ob die Präsenz solcher Pharmaka auch zu Veränderungen führt, die auf ultrastruktureller Ebene sichtbar sind. Ggf. könnten auf diesem Wege Parameter auch auf ultra­struk­tu­rel­ler Ebene identifiziert werden, die eine Beurteilung der Wirksamkeit potentieller Pharmaka für die Behandlung der o.g. Erkrankungen ermöglichen würden.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen em­bryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Über die Rolle der Synapsine für die Funktion von Synapsen liegt eine um­fang­rei­che Literatur vor. Verschiedene Arbeitsgruppen haben Untersuchungen an Mäusen durchgeführt, in denen die Gene für SYN1, SYN2 oder für beide Proteine deletiert wurden, und Neurone aus den entsprechenden knock out-Mäusen umfassend bezüglich ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften umfassend charakterisiert. Dabei wurden u.a. jeweils Veränderungen in der synaptischen (Kurzzeit)Plastizität infolge eines (funktionellen) knock out von SYN1 festgestellt, wobei jedoch teils verschiedene Veränderungen in den elektrophysiologischen Parametern sowie den Charakteristika der synaptischen Vesikel beobachtet wurden. Für eine mögliche Rolle von SYN1-Mutationen bei der Entwicklung bestimmter neuronaler Erkrankungen liegen ebenfalls hin­rei­chen­de Anhaltspunkte vor. SYN1-de­fi­zien­te Mäuse weisen – trotz des Fehlens ausgeprägter Ver­än­de­run­gen in der Hirn­mor­pho­lo­gie – mit zunehmendem Alter einen mehr oder minder ausgeprägten epileptischen Phänotyp auf. Zudem wurde gezeigt, dass ‒ neben der möglichen Beteiligung an der Entstehung neuronaler Erkrankungen ‒ die Gedächtnisleistung in SYN1-defizienten Mäusen (emotionales Gedächtnis, Objekterkennung) mit zunehmendem Alter be­ein­träch­tigt war. Auch im Menschen konnten in einigen Fällen Epilepsie sowie ASD (Autism Spectrum Disorders) mit Mutationen im SYN1-Gen assoziiert werden. Insofern ist es folgerichtig, mögliche synaptische Fehlfunktionen an SYN1-de­fi­zi­en­ten neuralen Zellen auch auf ultrastruktureller Ebene zu untersuchen.

Die genehmigten Forschungsarbeiten sind zudem Teil eines For­schungs­vor­ha­bens, das partiell im Ausland durchgeführt wurde. Im Rahmen der bereits durch­ge­führ­ten Arbeiten wurden die hier zur Nutzung vorgesehenen, SYN1-de­fi­zi­en­ten hES-Zellen etabliert, in Neurone differenziert und u.a. hinsichtlich ihrer elek­tro­phy­si­o­lo­gi­schen Eigenschaften charakterisiert, was bereits bestimmte Unter­schie­de zu aus Wildtyp-hES-Zellen abgeleiteten Neuronen offenbarte. Die hier ge­neh­mig­ten ultrastrukturellen Analysen der Synapsen hES-Zell-abgeleiteter Neurone, die eine SYN1-Defizienz aufweisen, und der Vergleich mit der Ultra­struk­tur von Wild­typ-Neuronen ist daher eine folgerichtige Fortsetzung dieser bereits erfolgreichen Forschungsarbeiten. Die zur Anwendung kom­men­den Vorgehensweisen sind ebenfalls umfassend vorgeklärt. Dies betrifft – neben der zur Anwendung kom­men­den Dif­fe­ren­zie­rungs­me­tho­de – insbesondere die Anwendung des flash and freeze-Verfahrens, das in der Ver­gan­gen­heit beispielsweise u.a. zur Analyse der Endozytose in Synapsen muriner Neurone verwendet wurde.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungs­vor­haben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Es wurde dargelegt, dass SYN1-defiziente humane Neurone teils andere elek­tro­physiologische Eigenschaften als murine Neurone mit einem ent­spre­chen­den ge­ne­ti­schen De­fekt aufweisen. Dies deutet darauf hin, dass SYN1 – trotzdem es evolutionär relativ stark konserviert ist – in verschiedenen Spezies teils unterschiedliche bzw. zusätzliche Funktionen haben könnte, so dass ein Funk­ti­ons­ver­lust ebenfalls mit verschiedenen Konsequenzen für die elektrophysiologischen und ultrastrukturellen Eigenschaften verbunden wäre. Die Bestimmung der Funktion von SYN1 für die Funktion humaner Synapsen kann folglich nicht durch Extrapolation von an murinen Zellen gewonnen Daten erfolgen, sondern erfordert die Nutzung humaner Zellen.

Primäre menschliche Hirnzellen sind kaum verfügbar und einer genetischen Veränderung, wie sie für das Forschungsvorhaben vorgenommen werden müsste, aller Voraussicht nach nicht zugänglich. Humane adulte neurale Stammzellen stehen nicht in für die Durchführung des Forschungsvorhabens ausreichenden Mengen zur Verfügung und Methoden zur zuverlässigen genetischen Manipulation dieser Zellen, wie sie für die Durchführung des Forschungsvorhabens erforderlich ist, stehen für diese Zellen nicht in gleichem Maße wie für humane pluripotente Stammzellen zur Verfügung. Fötale neurale Zellen, die aus abgetriebenen Föten gewonnen werden können, stehen ebenfalls nicht in für die Durchführung des Forschungsvorhabens aus­rei­chen­der Menge und Qualität zur Verfügung. Für die Erreichung der Forschungsziele ist daher die Verwendung humaner pluripotenter Stammzellen erforderlich.

Bezüglich der denkbaren Möglichkeit, die Forschungsarbeiten unter Nutzung von humanen induzierten pluripotenten Stamm­zellen (hiPS-Zellen) durch­zu­füh­ren, wurde dargelegt, dass die Verwendung von hiPS-Zellen aus mehreren Gründen nicht möglich ist. Zum einen erfordert die Durchführung des For­schungs­vor­habens die konditionale Mutagenese der pluripotenten Stamm­zellen, in deren Folge sich die verwendeten wildtyp- und mu­tier­ten Zellen aus­schließ­lich bezüglich der Präsenz des SYN1-Gens unterscheiden. Derartige kon­di­ti­o­na­le Mutagenesen wurden zur Modellierung von humanen Synap­to­pa­thi­en bislang ausschließlich für hES-Zellen publiziert, auf hiPS-Zellen basierende SYN1-de­fi­zi­en­te Zellen liegen nicht vor. Zudem ist fraglich, ob hiPS-Zellen, die dieselbe Mutation im SYN1-Gen aufweisen wie die bereits vorliegenden entsprechend mutierten hES-Zellen, einen identischen Phänotyp aufweisen würden. Zum anderen wurde auf die Tatsache verwiesen, dass hiPS-Zellen von ver­schie­de­nen Spendern, aber auch vom selben Spender, teils erhebliche Unterschiede in ihren Eigenschaften aufweisen. Diese können bei ver­schie­de­nen Spendern durch den jeweils unterschiedlichen genetischen Hintergrund oder das Alter des Spenders, beim selben Spender durch Re­pro­gram­mie­rungs­arte­fakte wie unvollständige Reprogrammierung oder re­pro­gram­mie­rungs­be­ding­te De-novo-Mutagenese, aber auch durch den für die Reprogrammierung genutzten Zelltyp (Blutzellen, Fibroblasten, Keratinozyten etc.) oder die für die Re­pro­gram­mie­rung gewählte Methode verursacht werden. Zudem können Unterschiede in der neuronalen Differenzierungsfähigkeit von hiPS-Zellen und hES-Zellen bestehen. Nach derzeitigem Kenntnisstand ist es daher erforderlich, die For­schungs­ar­bei­ten unter Verwendung von hES-Zellen durchzuführen.

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