96. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Universitätsklinikum Essen

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H7 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-4 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• I3 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I4 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I6 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• KhES-1 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Kyoto, Japan)
• KhES-2 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Kyoto, Japan)
• KhES-3 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Kyoto, Japan)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Ziel der Forschungsarbeiten ist die Etablierung eines Zellmodells für das Angelman-Syndrom, einer entwicklungsneurologischen Störung, die infolge eines Defekts des im Gehirn monoallelisch exprimierten Gens für eine Ubiquitin-Ligase (UBE3A) auftritt. Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten sollen hES-Zellen zum einen als Referenzmaterial für die Bestimmung der Eigenschaften, insbesondere der neuralen Differenzierungsfähigkeit, von für das Angelman-Syndrom spezifischen humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) genutzt werden. Zum anderen soll eine das Angelman-Syndrom bedingende UBE3A-Mutaion in hES-Zellen eingeführt werden, wodurch krankheitsspezifische pluripotente Zellen mit einem isogenen, standardisierten genetischen Hintergrund erzeugt werden können. Die neuronal differenzierten (krankheitsspezifischen) Zellen sollen dann u. a. bezüglich des allelspezifischen Imprintings untersucht werden. Schließlich sollen Strategien entwickelt und in vitro erprobt werden, um das paternale Allel für UBE3A zu reaktivieren.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung und des RKI überwiegend hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung von medizinischen Kenntnissen bei der Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren zur Anwendung bei Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Vom Angelman-Syndrom betroffene Patienten weisen zentralnervöse Entwicklungsstörungen auf, und adäquate Therapien für diese Erkrankung existieren derzeit nicht. Ursache für das Syndrom ist das Fehlen eines funktionell aktiven Produktes des im Gehirn monoallelisch exprimierten UBE3A-Gens auf Grund eines Gendefekts im mütterlichen Allel. Obgleich das Verständnis für die genetischen Ursachen des Angelman-Syndroms in den letzten Jahren vertieft werden konnte, sind die molekularen Vorgänge, die zur Ausprägung des krankheitsspezifischen Phänotyps führen, weiterhin nicht im Detail bekannt. Für die Aufklärung dieser Vorgänge werden humane Zellen benötigt, die den Phänotyp des Angelman-Syndroms aufweisen. An derartigen Zellmodellen ließen sich zahlreiche offene Fragen klären, wie beispielsweise jene nach dem Mechanismus des Neuron-spezifischen Imprintings, nach den Ursachen für die Beschränkung des Imprintings auf neuronale Zellen oder nach den (neuralen) Zelltypen des Nervensystems, die infolge des Gendefekts phänotypische Veränderungen aufweisen.

Die genehmigten Forschungsarbeiten zielen zunächst auf die Etablierung eines entsprechenden Zellmodells auf der Basis von hiPS-Zellen aus einem Patienten mit Angelman-Syndrom. Im Gegensatz zu vielen anderen Patienten, die ausgedehnte Mutationen im betreffenden Lokus aufweisen, liegt im betroffenen Patienten nur eine kleine Deletion im UBE3A-Gen vor. hES-Zellen dienen zum einen als Referenzmaterial, um beurteilen zu können, ob die krankheitsspezifischen hiPS-Zellen die Eigenschaften pluripotenter Stammzellen aufweisen, insbesondere hinsichtlich ihres neuralen Differenzierungspotentials. Zum anderen sollen sie aber auch zur Etablierung einer krankheitsspezifischen pluripotenten Stammzell-Linie verwendet werden, die dieselbe genetische Veränderung im UBE3A-Gen aufweist wie der betroffene Patient. Auf diesem Wege soll – zusätzlich zu patientenspezifischen hiPS-Zellen – eine gut definierte, krankheitsspezifische hES-Zell-Linie erzeugt werden, in der die Auswirkungen einer kleinen Deletion im UBE3A-Gen isoliert und unabhängig von möglichen weiteren genetischen Veränderungen, die beispielsweise in den Zellen des Patienten zum Zeitpunkt der Zellentnahme bestanden oder sich infolge des Reprogrammierungsprozesses gebildet haben, vor einem isogenen Hintergrund untersucht werden können. Dies kann zur Gewinnung weiterer Erkenntnisse über die spezifischen Effekte einer Mutation im UBE3A-Gen auf den Phänotyp der betroffenen Zellen und zu einem tieferen Verständnis der Rolle des entsprechenden Genprodukts und der molekularen Konsequenzen seines Fehlens in menschlichen neuronalen Zellen bilden.

Die im Vorhaben erzeugten, krankheitspezifischen pluripotenten Stammzellen sowie aus ihnen abgeleitete neurale Vorläuferzellen und Neuronen sollen auch zur Entwicklung von Vorgehensweisen für eine Reaktivierung des (im Normalzustand abgeschalteten) paternalen Allels für UBE3A genutzt werden. Dabei sollen verschiedene Strategien zum Einsatz kommen, um das für die Inaktivierung des paternalen UBE3A-Allels maßgebliche Antisense-Produkt (UBE3A-ATS) zu inaktivieren. Im Erfolgsfall ließen sich auf Grundlage der Ergebnisse dieser Versuche ggf. neue Ansätze für eine Therapie des Angelman-Syndroms durch Repression der UBE3A-ATS-Expression entwickeln.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass die im Forschungsvorhaben zu klärenden wissenschaftlichen Fragestellungen vorgeklärt sind.

Die genetischen Grundlagen des Angelman-Syndroms, die ursächliche Beteiligung von UBE3A-Defekten an der Erkrankung sowie die Rolle von UBE3A-ATS bei der Etablierung und Aufrechterhaltung des Imprinting des paternalen Allels sind bekannt. Für das Angelman-Syndrom existieren mehrere Mausmodelle, in denen entweder das UBE3A-Gen durch homologe Rekombination mutiert oder in denen eine große Deletion des entsprechenden Gen-Lokus induziert wurde. Betroffene Mäuse zeigen für die Krankheit typische Symptome und weisen mit dem Angelman-Syndrom einhergehende Veränderungen in der neuronalen Morphologie sowie eine verminderte synaptische Plastizität auf. Ferner existiert bereits ein auf iPS-Zellen beruhendes humanes Zellmodell des Angelman-Syndroms, in dem das Imprinting des paternalen UBE3A-Allels während der neuralen Differenzierung etabliert wurde, was mit einer Abschaltung der UBE3A-Expression einherging.

Verschiedene Möglichkeiten, die zur Reaktivierung der Expression des UBE3A-Gens vom paternalen Allel genutzt werden sollen, sind in der Literatur im Zusammenhang mit anderen Zellmodellen bereits beschrieben worden. Die grundsätzliche Möglichkeit, durch Repression von UBE3A-ATS das paternale UBE3A-Gen zu aktivieren, wurde beispielsweise in einem murinen Zellmodell des Angelman-Syndroms gezeigt. Methoden für die neuronale Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen sowie Methoden zur Erzeugung von spezifischen Mutationen in hES-Zellen sind in der Vergangenheit etabliert und in der wissenschaftlichen Literatur umfangreich dokumentiert worden.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte wissenschaftliche Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Das im Rahmen der beantragten Forschungsarbeiten zu etablierende Zellmodell soll genutzt werden, um die Pathogenese des Angelman-Syndroms auf molekularer Ebene künftig weiter untersuchen zu können. Bereits im Rahmen des aktuellen Forschungsvorhabens sollen  Ansatzpunkte für mögliche künftige Therapien für diese Erkrankung gefunden werden. Zwar existieren verschiedene Mausmodelle für das Angelman-Syndrom, die sowohl die Symptomatik der Krankheit als auch molekulare Veränderungen auf zellulärer Ebene teils gut widerspiegeln. Jedoch gibt es offenbar Unterschiede zwischen Maus und Mensch, beispielsweise hinsichtlich der UBE3A-ATS-Transkripte, was darauf hindeutet, dass die Regulation des UBE3A-Gens und seiner Expression speziesspezifische Unterschiede aufweist. Folglich muss das Zellmodell unter Nutzung menschlicher Zellen etabliert werden.

Der Focus des Vorhabens liegt auf der Modellierung des Angelman-Syndroms unter Nutzung von hiPS-Zellen eines Patienten mit einer spezifischen Mutation des UBE3A-Gens. Hierfür wird ein Referenzmaterial benötigt, anhand dessen der Erfolg der Reprogrammierung und der neuronalen Differenzierung abgeschätzt werden kann. Der ausschließlichen Nutzung von Wildtyp-hiPS-Zellen als Referenzmaterial stehen teils starke Linien-spezifische Unterschiede im neuronalen Differenzierungspotential sowie der derzeit nicht abschätzbare Einfluss einer unvollständiger Reprogrammierung, eines möglichen epigenetischen Gedächtnisses und eines potentiellen, derzeit nicht geklärten Einflusses der Restexpression von zur Reprogrammierung verwendeten und in das Genom der Zellen integrierten (Onko)Genen entgegen. Daher ist die Verwendung von hES-Zellen als Referenzmaterial erforderlich. hES-Zellen sollen ferner genutzt werden, um die oben benannte Mutation auf einem isogenen Hintergrund zu erzeugen. Obwohl isogene Wildtyp-Zellen auch durch Korrektur der Mutation in den patientenspezifischen iPS-Zellen erzeugt werden könnten, bliebe das Problem möglicher Reprogrammierungseffekte auf die Eigenschaften der pluripotenten Zellen und daraus abgeleiteter Derivate bestehen.

Die Forschungsziele können voraussichtlich auch nicht unter Verwendung anderer als pluripotenter menschlicher Zellen (beispielsweise adulter neuraler Stammzellen oder von neuralen Zellen aus abgetriebenen Föten) erreicht werden, da diese Zellen frühe Schritte der neuralen Differenzierung bereits durchlaufen haben. Ferner ist nicht bekannt, ob und inwieweit diese Zellen in die vom UBE3A-Gendefekt phänotypisch betroffenen Zelltypen differenzieren können.

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