92. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaberin

Frau Dr. Jennifer Winter, Universitätsmedizin Mainz

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H7 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HUES1 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES2 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES4 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES6 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES7 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES8 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES10 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• NCL-3 (Newcastle Fertility Centre, Newcastle upon Tyne, Großbritanninen)
• NCL-4 (Newcastle Fertility Centre, Newcastle upon Tyne, Großbritanninen)

Die Genehmigung gilt auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Die genehmigten Forschungsarbeiten sollen zu einem verbesserten Verständnis des Opitz BBB/G-Syndroms führen, das zu Fehlbildungen in Derivaten der Neuralleiste und Defekten in der neuralen Entwicklung führt. Die hier interessierende, an das X-Chromosom gebundene Form dieser Erkrankung wird durch eine Mutation im MID1-Gen verursacht. Gegenstand der Forschungsarbeiten ist es, die Funktion von MID1 in Neuralleistenzellen und deren Derivaten sowie in neuralen (Vorläufer)Zellen des Menschen näher zu bestimmen und die Folgen einer Mutation von MID1 auf molekularer Ebene zu analysieren. Dazu sollen humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen), in denen ein mutiertes MID1-Gen überexprimiert wird bzw. die Expression von MID1 vermindert oder ausgeschaltet ist, in Neuralleistenzellen und deren Derivate differenziert und diese hinsichtlich einer veränderten Aktivierung von bestimmten Signalwegen und möglicher Konsequenzen für das Differenzierungsvermögen der Zellen, für ihre Proliferation, Migration und Vitalität untersucht werden. Die genetisch veränderten hES-Zellen sollen ferner in neurale Vorläuferzellen und in kortikale Neurone differenziert und auch hier der Effekt der veränderten Expression des Gens für MID1 analysiert werden. Neben Proliferationsfähigkeit, Migrationsverhalten und Apoptoserate sollen u. a. umfangreiche Analysen auf den Ebenen des Transkriptoms und Proteoms vorgenommen, mögliche Veränderungen in bestimmten Signalwegen analysiert und die Fähigkeit der aus diesen Zellen abgeleiteten Neurone zur Bildung von Axonen, Dendriten und Synapsen bestimmt werden. Schließlich sollen die an hES-Zellen gewonnenen Erkenntnisse auf hiPS-Zellen übertragen und die in diesen Zellen erlangten Ergebnisse mit jenen aus hES-Zellen verglichen werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung und des RKI vornehmlich hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn für die Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Das Opitz-BBB/G-Syndrom (Opitz Syndrome, OS) ist eine Erbkrankheit mit typischen Fehlbildungen der ventralen Mittellinie. Die X-chromosomal vererbte Form des OS wird durch Mutationen im MID1-Gen bedingt. Zwar wurde die Wirkungsweise von MID1 auf molekularer Ebene umfassend untersucht, jedoch sind die downstream liegenden Signalwege, die eine Fehlfunktion von MID1 mit den phänotypischen Effekten des OS verbinden, derzeit wenig verstanden. Zudem bestehen nur lückenhafte Kenntnisse über die Auswirkungen einer Fehlfunktion von MID1 auf die neurale Differenzierung beim Menschen.

Die genehmigten Forschungsarbeiten sollen klären helfen, welche spezifischen Funktionen MID1 in humanen Neuralleistenzellen sowie in aus diesen abgeleiteten Zellen ausübt und welche Folgen eine fehlende oder veränderte Expression des MID1-Gens in diesen Zellen auf molekularer Ebene, insbesondere für die Aktivität bestimmter Signalwege, hat. Ferner soll bestimmt werden, inwieweit hierdurch ein verändertes Migrationsverhalten humaner Neuralleistenzellen in vitro bewirkt und die Vitalität dieser Zellen beeinträchtigt werden. Dies ist von erheblichem Interesse, da die im Zusammenhang mit dem OS auftretenden Fehlbildungen mit einer Hemmung der Migration und/oder einer Verminderung der Vitalität von Neuralleistenzellen in Zusammenhang gebracht worden sind. Zudem könnten mit dem gewählten Ansatz erstmals die Auswirkungen von MID1-Defekten auf die Differenzierungsfähigkeit humaner Neuralleistenzellen untersucht und ein möglicher Zusammenhang zwischen einem potentiell veränderten Differenzierungsvermögen infolge des MID1-Defektes und phänotypischen Effekten bei OS hergestellt werden. Diese Untersuchungen können folglich dazu beitragen, die molekularen Grundlagen des OS in Neuralleistenzellen aufzuklären.

Weiterhin sollen die Auswirkungen einer veränderten MID1-Aktivität in humanen neuronalen Zellen untersucht werden. Hier soll insbesondere überprüft werden, inwieweit Komponenten intrazellulärer Signalwege durch mutiertes oder fehlendes MID1 beeinträchtigt sind, ferner welche Veränderungen im globalen Transkriptom und Proteom auftreten und welche möglichen Einschränkungen in der Fähigkeit der betroffenen neuralen Vorläuferzellen zur Differenzierung in kortikale Neuronen bestehen. Daraus werden u. a. Erkenntnisse über die Rolle von MDM1 während der humanen neuralen Entwicklung und Hinweise auf mögliche funktionelle Defizite von Neuronen erwartet, in denen die Expression von MID1 verändert ist. Aus den Untersuchungen wird Aufschluss über mögliche Fehlentwicklungen infolge der das OS bedingenden Mutationen in der Differenzierung und Reifung neuraler Zellen erwartet, was ebenfalls zu einem verbesserter Verständnis dieser Erkrankung beitragen soll.

Die an hES-Zellen gewonnenen Ergebnisse sollen dann an Neuralleistenzellen bzw. Neuronen überprüft werden, die aus wildtyp-hiPS-Zellen bzw. aus hiPS-Zellen von Patienten mit OS abgeleitet werden sollen, wobei hES-Zellen hierfür als Referenzmaterial genutzt werden sollen. Auf Grundlage dieser vergleichenden Analysen sollen ggf. Zellmodelle für die Untersuchung weiterer Aspekte des OS auf molekularer und zellulärer Ebene etabliert werden. An derartigen Zellmodellen können künftig nicht nur neue Erkenntnisse über die mit dem OS zusammenhängenden Veränderungen in der Differenzierung humaner Zellen gewonnen, sondern ggf. auch neue Wirkstoffe zur Behandlung dieser Erkrankung identifiziert und überprüft werden.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

In der Literatur liegen umfangreiche Daten über die Funktionen von MID1 vor; der Zusammenhang zwischen der X-Chromosom-gekoppelten Form des OS und Mutationen im MID1-Gen ist in der Literatur ebenfalls gut belegt. Jüngere Studien weisen zudem auf eine erhebliche Rolle von MID1 bei der neuralen Differenzierung hin. So wird das MID1-Gen ab Tag 14 im zerebralen Cortex der sich entwickelnden Maus exprimiert. Ein knock out des MID1-Gens führt hier zu einer Verlängerung der Axone und deren stärkerer Verzweigung, die Expression eines verkürzten MID1-Gens, wie es in bestimmten Fällen auch bei OS im Menschen auftritt, zur Beeinträchtigung der Migration neuronaler Zellen und zu einer verminderten Entwicklung von Axonen. Es ist ferner gezeigt worden, dass MID1 mittelbar die Migrationsgeschwindigkeit von Neuralleistenzellen im sich entwickelnden Hühnerembryo reguliert. Ferner ist aus der Literatur bekannt, dass MID1 in die Regulation hier interessierender Signalwege involviert ist.

Die Frage danach, wie eine veränderte MID1-Expression die Eigenschaften humaner Neuralleistenzellen oder Neuronen beeinträchtigt und welche Rolle dabei die hier interessierenden Signalwege spielen, wurde unter Verwendung von Zellen anderer Spezies (Maus, Huhn) umfassend vorgeklärt. Zu anderen Inhalten des Projektes, insbesondere zur geplanten Etablierung von Protokollen für die effiziente Differenzierung humaner ES-Zellen in Neuralleistenzellen, neurale Vorläuferzellen und kortikale Neuronen, liegen bereits umfangreiche Studien an hES-Zellen selbst vor, so dass eine Vorklärung an anderen Zellen hier nicht mehr erforderlich ist.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Ziel des Forschungsvorhabens ist die Etablierung eines Zellmodells, an dem die molekularen Grundlagen des OS erforscht werden können. Dafür werden Zellen benötigt, die den Phänotyp des OS auf zellulärer und subzellulärer Ebene möglichst genau abbilden. Tierische Zellen, insbesondere solche aus der Maus, sind hierfür jedoch ungeeignet. Mäuse, in denen das MID1-Gen deletiert wurde, weisen beispielsweise nur einen milden OS-Phänotyp auf, so dass davon ausgegangen wird, dass die Funktion von MID1 bei der neuralen Entwicklung in verschiedenen Spezies unterschiedlich ist. Zur Erreichung der Forschungsziele werden folglich humane Zellen benötigt.

Die Forschungsziele lassen sich nach derzeitigem Kenntnisstand nicht unter Verwendung adulter Stammzellen des Menschen erreichen. Zwar lassen sich adulte Neuralleistenzellen aus verschiedenen Geweben gewinnen und in bestimmte Zelltypen differenzieren. Jedoch ist ihr Proliferationsvermögen in Zellkultur begrenzt, und es ist nicht bekannt, ob und inwieweit diese Neuralleistenzellen die gleichen Charakteristika besitzen wie die hier interessierenden embryonalen Neuralleistenzellen, deren Eigenschaften wie Migrationsverhalten und Differenzierungsfähigkeit unter dem Einfluss der Fehlexpression des MID1-Gens bestimmt werden sollen. Auch fötale humane Stammzellen können nicht zur Erreichung der Forschungsziele genutzt werden. Die hier zunächst interessierenden humanen Neuralleistenzellen treten lediglich in einem sehr frühen Stadium der embryonalen Entwicklung und nur kurzzeitig auf. Sie können aus abgetriebenen Föten i. allg. nicht gewonnen werden. Neurale Stammzellen können aus abgetriebenen Föten zwar gewonnen werden, jedoch nicht reproduzierbar und in den für die Projektdurchführung erforderlichen Mengen. Immortalisierte fötale neurale Stammzellen sind zwar verfügbar, jedoch ist ihre Differenzierungsfähigkeit in Richtung der hier benötigten funktionellen kortikalen Neuronen nicht belegt.

Es gibt derzeit auch keine Belege dafür, dass die Forschungsziele unter ausschließlicher Verwendung von hiPS-Zellen erreichbar sind. Die Frage, ob und inwieweit hiPS-Zellen ein zu hES-Zellen vergleichbares Differenzierungspotential in Richtung von Neuralleistenzellen aufweisen, ist zur Zeit nur in Ansätzen untersucht und soll erst im Rahmen der hier beantragten vergleichenden Studien untersucht werden. Zudem bestehen keine Kenntnisse über die Aktivität der hier interessierenden Signalwege in hiPS-Zellen. Ferner zeigte sich gerade bei der neuralen Differenzierung von hiPS-Zellen eine teils deutlich stärkere Variabilität des Differenzierungserfolges in Abhängigkeit von den genutzten Zell-Linien, als dies bei hES-Zellen der Fall ist. Schließlich sollen die Arbeiten auch im Vergleich zwischen hiPS- und hES-Zellen durchgeführt werden, um Aufschluss darüber zu erlangen, ob (wildtyp-)hiPS-Zellen in ihrer Fähigkeit, sich in vitro zu Neuralleistenzellen und kortikalen Neuronen zu entwickeln, sowie hinsichtlich des Einflusses von MID1 auf diese Prozesse hES-Zellen gleichen oder ob hier ggf. Unterschiede bestehen.

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