73. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Herr Dr. Alessandro Prigione (bis September 2012 Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin, seit Oktober 2012 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC), Berlin)

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand eines ersten Teilprojektes ist es, den Einfluss der Reprogrammierung somatischer Zellen zu humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) auf Funktionen und Eigenschaften der Mitochondrien zu bestimmen. Insbesondere soll der Effekt unterschiedlicher Reprogrammierungsmethoden und Kultivierungsverfahren, der Einfluss bestimmter zellulärer Signalwege sowie die Rolle der Langzeitkultivierung mit Blick auf die Eigenschaften der Mitochondrien der reprogrammierten Zellen im Vergleich zu Mitochondrien von hES-Zellen analysiert werden. Dabei sollen u. a. mögliche Veränderungen in der mitochondrialen DNA, der Energiestoffwechsel sowie das mitochondriale Metabolom und Transkriptom untersucht werden. Um einen möglichen Einfluss der Mitochondrien-Reprogrammierung auf die Differenzierung pluripotenter Zellen bestimmen zu können, sollen hES- und hiPS-Zellen in solche Zelltypen differenziert werden, die einen hohen Energieumsatz haben, und die differenzierten Zellen insbesondere bezüglich des Reifegrades und der Funktionalität ihrer Mitochondrien untersucht werden.

In einem zweiten Teilprojekt sollen dann hiPS-Zellen aus Zellen von Patienten hergestellt werden, die Mutationen im Mitochondriengenom aufweisen. Ziel dieser Arbeiten ist die Entwicklung von Zellmodellen für Erkrankungen, die auf funktionalen mitochondrialen Defekten beruhen. hES-Zellen dienen hier für Vergleichszwecke zur Bestimmung der für Pluripotenz maßgeblichen Eigenschaften der gewonnenen hiPS-Zellen. Die krankheitspezifischen hiPS-Zellen sowie ihre differenzierten Derivate sollen dann bezüglich möglicher Veränderungen untersucht werden, beispielsweise in der Morphologie, im Energiestoffwechsel und im Redox-Status der Mitochondrien sowie auf der Ebene des Transkriptoms und des Proteoms. Diese Untersuchungen werden ebenfalls zu Vergleichszwecken an hES-Zellen durchgeführt.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Gegenstand der genehmigten Arbeiten ist zum einen die Untersuchung der Fragestellung, inwieweit Mitochondrien reprogrammierter menschlicher Zellen jenen von hES-Zellen gleichen. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeiten liegt auf der Etablierung von Zellmodellen humaner Erkrankungen, die mit Fehlfunktionen mitochondrialer Gene verbunden sind. Durch Erzeugung und Analyse entsprechender krankheitsspezifischer hiPS-Zell-Linien sowie deren Differenzierung in verschiedene Zelltypen soll geklärt werden, ob die Mitochondrien dieser Zellen charakteristische Unterschiede zu jenen von hES-Zellen aufweisen.

Mitochondrien von hES-Zellen weisen im Vergleich zu jenen somatischer Zellen einen geringen oxidativen und somit einen überwiegend anaeroben Stoffwechsel auf und zeigen deutliche Unterschiede in der Morphologie und im Reifegrad. Erst während der Differenzierung reifen die Mitochondrien und entwickeln ihre volle funktionelle Aktivität. Obwohl für hES- und hiPS-Zellen in vorangegangenen Untersuchungen ähnliche Eigenschaften nachgewiesen wurden, ist nicht geklärt, ob und in welchem Ausmaß während der zellulären Reprogrammierung Veränderungen im mitochondrialen Energiestatus und in der mitochondrialen DNA auftreten und ob durch die Reprogrammierung der unreife Phänotyp der Mitochondrien, wie er für hES-Zellen typisch ist, vollständig hergestellt wird. Im genehmigten Forschungsvorhaben soll geklärt werden, ob die Methode der Reprogrammierung somatischer Zellen zu hiPS-Zellen und die Bedingungen für deren Kultivierung einen Einfluss auf die mitochondriale Reprogrammierung haben. Auf diesem Wege können wesentliche Kenntnisse darüber erlangt werden, ob und inwieweit sich auf unterschiedliche Weise erzeugte und unter verschiedenen Bedingungen kultivierte hiPS-Zellen in ihren mitochondrialen Eigenschaften und in der Integrität der mitochondrialen DNA untereinander und von hES-Zellen unterscheiden. Das angestrebte umfassendere Verständnis von den Eigenschaften der Mitochondrien reprogrammierter Zellen und ihrer Beeinflussung durch die Bedingungen der Reprogrammierung und Kultivierung kann ggf. auch dazu beitragen, die Verfahren zur Gewinnung von hiPS-Zellen künftig zu optimieren.

Im zweiten Projektteil sollen auf hiPS-Zellen basierende Krankheitsmodelle etabliert werden, an denen künftig zell- und molekularbiologische Grundlagen pathogener Prozesse aufgeklärt werden können, die mit Mitochondriopathien assoziiert sind und sich auf Mutationen des mitochondrialen Genoms zurückführen lassen. Hierzu sollen somatische Zellen von Patienten mit entsprechenden Erkrankungen reprogrammiert und entsprechende hiPS-Zell-Linien etabliert werden. Diese sollen dann in jene Zelltypen differenziert werden, die von der jeweiligen Krankheit in besonderem Maße betroffen sind. Die Untersuchungen, die im Vergleich mit hES-Zellen erfolgen, sollen Aussagen über die Genotyp-Phänotyp-Korrelationen bei den entsprechenden genetisch bedingten Erkrankungen ermöglichen und ggf. Erkenntnisse über die Bedeutung bestimmter Mutationen im Mitochondriengenom auf die Differenzierungsfähigkeit in spezifische Zelltypen und die Eigenschaften ihrer Mitochondrien zulassen. Mittels der im Vorhaben zu etablierenden Zellmodelle könnte so auch ein besseres Verständnis von Mitochondrien-Fehlfunktionen bei der Differenzierung menschlicher Zellen erlangt werden. Untersuchungen an solchen Zellmodellen könnten künftig das Verständnis über Pathogenese-Prozesse infolge von mitochondrialen Fehlfunktionen verbessern und eventuell die Kenntnisse zu ihrer Entstehung und Beeinflussung durch Wirkstoffe erweitern helfen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Es ist bekannt, dass bei der Reprogram­mierung von somatischen Zellen des Menschen die Morphologie, Aktivität und Funktion von Mitochondrien der somatischen Zellen in Richtung eines Zustandes verändert werden, der dem der Mitochondrien humaner ES-Zellen entspricht. Es liegen bereits mehrere Veröffentlichungen vor, in denen die Mitochondrien von hES- und hiPS-Zellen vergleichend untersucht wurden. Methoden für die Differenzierung von hES-Zellen in jene Zelltypen, die im genehmigten Vorhaben aus hES-Zellen gewonnen werden sollen (postmitotische Neuronen, Kardiomyozyten, Muskelzellen, retinale Zellen und Fibroblasten)sind in der Literatur umfassend beschrieben.

Auch an Mitochondrien undifferenzierter muriner ES-Zellen wurden Untersuchungen, beispielsweise zur Replikation der mitochondrialen DNA, durchgeführt. Es liegen jedoch deutlich umfangreichere Daten zur Struktur und zum Metabolismus der Mitochondrien pluripotenter humaner Zellen vor, so dass Untersuchungen an anderen, beispielsweise tierischen Zellen zur weiteren inhaltlichen Vorklärung der wissenschaftlichen Fragestellungen des Projektes nicht erforderlich sind. Bekannt ist auch, dass verschiedene Spezies teils erhebliche Unterschiede in den molekularen Grundlagen von Pluripotenz aufweisen.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Im ersten Teil des genehmigten Vorhabens soll untersucht werden, ob die Bedingungen der Reprogrammierung Einfluss auf die Eigenschaften der Mitochondrien der reprogrammierten Zellen haben und ob und inwieweit sich die Mitochondrien der auf verschiedenen Wegen hergestellten hiPS-Zellen von jenen pluripotenter humaner Stammzellen unterscheiden. Dazu werden als konstantes Bezugssystem originäre pluripotente Stammzellen des Menschen benötigt. Dies sind aber nach gegenwärtigem Kenntnisstand alleine hES-Zellen. Pluripotente Stammzellen anderer Spezies eignen sich hier als Bezugssystem nicht, da sie sich sowohl in den molekularen Grundlagen ihrer Pluripotenz als auch in den Eigenschaften ihrer Mitochondrien von hES-Zellen teils deutlich unterscheiden. Auch andere Stammzellen des Menschen, beispielsweise fötale oder somatische Stammzellen, sind allein bereits auf Grund des fortgeschrittenen Reifegrades ihrer Mitochondrien nicht als Vergleichsstandard für die hier geplanten Untersuchungen geeignet.

Auch für die Untersuchung der zellulären Grundlagen von mitochondrial verursachten Erkrankungen an hiPS-Zellen sind als Vergleichsstandard für die Untersuchung von für Pluripotenz maßgeblichen Eigenschaften, gezielter Differenzierung in spezifische Zelltypen und deren vergleichende Analyse allein gut charakterisierte hES-Zellen geeignet. Die ausschließliche Nutzung von hiPS-Zellen für Vergleichszwecke ist wegen deren teils erheblicher Heterogenität, die z.B. auf das Alter der für die Reprogrammierung genutzten somatischen Zellen und auf das jeweils genutzte Verfahren der Reprogrammierung zurückzuführen ist, hier nicht ausreichend. Die Heterogenität verschiedener hiPS-Zell-Linien kann beispielsweise deren epigenetischen Status, bestimmte Stoffwechselwege oder Mutationen betreffen, die durch die Reprogrammierung in der nuklearen und mitochondrialen DNA ausgelöst wurden, und geht ggf. mit einem stark variierenden Differenzierungsvermögen einher.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 29.04.2014

Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Verwendung von hES-Zellen für die Durchführung zusätzlicher Forschungsarbeiten.

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Ziel der genehmigten weiteren Forschungsarbeiten ist die Klärung der Frage, welche Rolle eine mögliche Dysfunktion von Mitochondrien bei der Pathogenese degenerativer Erkrankungen des Nervensystems spielt. In diesem Zusammenhang soll zunächst untersucht werden, welchen spezifischen Veränderungen Mitochondrien im Prozess der neuralen Differenzierung unterliegen, ob hierbei Unterschiede zwischen hiPS- und hES-Zellen bestehen und ob die Integrität der mitochondrialen DNA während der neuralen Differenzierung erhalten bleibt. Ferner soll die Funktion von Transposons bei der neuronalen Musterbildung bestimmt und eine mögliche Rolle des Adapterproteins p97 auf die Mitochondriendynamik und den Energiestoffwechsel sich neural differenzierender Zellen untersucht werden. Weiterhin sollen Zellmodelle für Erkrankungen des Nervensystems etabliert werden, die nach gegenwärtigem Kenntnisstand auch mit einer veränderten Mitochondrienfunktion in neuralen Zellen einhergehen. Im Zuge der geplanten Arbeiten, für die hES-Zellen als Referenzmaterial genutzt werden sollen, sollen krankheitsspezifische hiPS-Zellen in verschiedene neuronale Zelltypen differenziert und diese hinsichtlich von Parametern der Mitochondrienfunktion, insbesondere nach Induktion von zellulärem Stress, analysiert werden.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Die Forschungsarbeiten sollen Erkenntnisse über mögliche Unterschiede zwischen aus hES- und hiPS-Zellen gewonnenen neuralen Zellen in Bezug auf die Eigenschaften ihrer Mitochondrien erbringen und die Frage klären helfen, ob sich beide Zelltypen in gleicher Weise für die Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen nutzen lassen. Veränderungen im Energiestoffwechsel während der Differenzierung von hES-Zellen in spezifische (Sub)Typen neuronaler und glialer Zellen sowie damit einhergehende Veränderungen in der Zahl, Struktur und Funktion von Mitochondrien sind bislang nur ansatzweise untersucht worden. Gleiches gilt für diese Fragen im Zusammenhang mit der neuralen Differenzierung von hiPS-Zellen. Die geplante detaillierte Untersuchung von Veränderungen in der Struktur und in den biochemischen Eigenschaften von Mitochondrien in verschiedenen Typen neuraler Zellen, die aus hES- bzw. hiPS-Zellen abgeleitet werden, kann wichtige Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen Mitochondrienaktivität und neuraler Differenzierung sowie über Veränderungen im Energiestoffwechsel von sich neural differenzierenden humanen pluripotenten Stammzellen erbringen.

Ferner sollen hES-Zellen sollen als Referenzmaterial verwendet werden, um die Pluripotenz von hiPS-Zellen aus Patienten beurteilen zu können, die unter schweren neurodegenerativen Erkrankungen leiden. Insbesondere sollen das neurale Differenzierungsvermögen der entsprechenden hiPS-Zellen beurteilt und die Eigenschaften ihrer Mitochondrien bewertet werden. Durch die geplanten Untersuchungen der mitochondrialen Eigenschaften sowie des Energiestoffwechsels von neuralen Zellen, die aus krankheitsspezifischen iPS-Zellen gewonnen werden, sollen neue Erkenntnisse darüber erlangt werden, ob und auf welchem Wege die Mitochondrienfunktion durch diese Erkrankungen beeinträchtigt wird und welche Moleküle und Signalwege daran beteiligt sind. Dies kann zu einem vertieften Verständnis der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen führen; ggf. können auch Ansatzpunkte für neue Therapie dieser Erkrankungen gefunden werden.

Vorklärung und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen

Fragen zur metabolischen Reprogrammierung humaner somatischer Zellen wurden bereits in der Vergangenheit untersucht.  Gleichfalls liegen bereits mehrere Studien zur Frage vor, welche Veränderungen bezüglich metabolischer Eigenschaften sowie hinsichtlich der Charakteristika von Mitochondrien während der Differenzierung von hES-Zellen ablaufen. Mit Blick auf Veränderungen im Energiestoffwechsel embryonaler Stammzellen der Maus während deren Differenzierung und damit zusammenhängend in der Zahl, Struktur und Lokalisation der Mitochondrien liegt eine umfangreiche Literatur vor. Ferner wurde im Maussystem bereits gezeigt, dass neben der Regulation des Energiestoffwechsels auch die mitochondriale DNA differenzierungsbedingten Änderungen unterliegt. Insgesamt ist gut belegt, dass metabolische Signaturen und mitochondriale Funktionen stark mit dem Differenzierungsstadium von Zellen korreliert sind und im Laufe der Entwicklung zu spezifischen Zelltypen Veränderungen erfahren. Auch die Beteiligung mitochondrialer Dysfunktionen an der Genese neurodegenerativer Erkrankungen des Menschen ist in zahlreichen Studien beschrieben worden, und (auf hiPS-Zellen basierende) humane Zellmodelle für neurodegenerative Erkrankungen wie Morbus Parkinson und Morbus Huntington wurden in der Vergangenheit bereits zur Untersuchung entsprechender Fragestellungen verwendet. Protokolle für die Differenzierung von hES-Zellen in verschiedene Typen des Zentralnervensystems sind in der wissenschaftlichen Literatur publiziert und beim Genehmigungsinhaber weiterentwickelt worden.

Zur Erreichung der wissenschaftlichen Zielstellungen des Forschungsvorhabens werden hES-Zellen benötigt. Voraussetzung für die Verwendung hiPS-Zell-basierter neuraler Zellmodelle zur Untersuchung von Mitochondrienfunktionen ist, dass die Mitochondrien von aus hiPS-Zellen abgeleiteten Neuronen authentische Eigenschaften aufweisen. Um dies bestimmen zu können, ist ein geeignetes humanes Referenzmaterial erforderlich. Humane Neurone sind aber derzeit nur aus hES-Zellen in für die Projektdurchführung ausreichender Menge und Qualität gewinnbar, primäres menschliches Material steht hier nicht zur Verfügung. Nicht-humane pluripotente Zellen, beispielsweise ES-Zellen anderer Spezies, können zur Gewinnung eines neuralen Referenzmaterials nicht verwendet werden, da die Voraussetzungen für die Aufrechterhaltung von Pluripotenz und die Induktion von Differenzierung für ES-Zellen verschiedener Spezies unterschiedlich sind. Zudem weisen spezialisierte Neuronen verschiedener Spezies physiologische Unterschiede auf, die auch die Mitochondrienfunktion betreffen können. Zudem erfordert die Untersuchung der Frage, welchen Veränderungen die Mitochondrienfunktion in sich neural differenzierenden humanen Zellen unterliegt, die In-vitro-Nachbildung von Differenzierungsprozessen in ein breites Spektrum neuraler Zelltypen. Nach derzeitigem Kenntnisstand weisen nur hES-Zellen ein entsprechendes Differenzierungspotential auf und sind folglich als Referenzmaterial geeignet. Andere Stammzellen (beispielsweise adulte oder aus abgetriebenen Föten gewonnene neurale Stammzellen des Menschen) besitzen nicht das hier erforderliche breite Differenzierungspotential in eine Vielzahl unterschiedlicher neuraler Zelltypen und sind daher als Referenzmaterial nicht geeignet.

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