72. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Frau Dr. Claudia Claus, Universität Leipzig

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H7 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Ziel der genehmigten Arbeiten ist die Etablierung eines auf humanen ES-Zellen basierenden Modells für die Untersuchung der Auswirkungen einer Infektion mit Rötelnvirus (Rubella-Virus, RV) auf Zellen des frühen menschlichen Embryos. Hintergrund ist das hohe teratogene Potential von RV, dessen molekulare Grundlagen bislang wenig verstanden sind.

In einem ersten Teilprojekt soll analysiert werden, ob und inwieweit hES-Zellen von RV infiziert werden können und ob RV eine produktive Infektion auf hES-Zellen etablieren kann. Dabei sollen die unmittelbaren Konsequenzen einer RV-Infektion für hES-Zellen bestimmt werden, beispielsweise in Hinblick auf die Vitalität der Zellen, auf ihre Teilungsraten, auf die Expression von Markergenen für Pluripotenz sowie auf Apoptose- bzw. Nekroseraten. Ferner soll das Genexpressionsprofil RV-infizierter Zellen analysiert und insbesondere der Effekt der Infektion auf die Anzahl und intrazelluläre Lokalisation der Mitochondrien in hES-Zellen untersucht werden. In einem zweiten Teilprojekt sollen dann die Auswirkungen der RV-Infektion auf die Mitochondrienfunktion bestimmt werden. Dabei sollen insbesondere Komponenten der Atmungskette hinsichtlich ihrer Expression und Funktion analysiert, der ATP-Gehalt der Zellen und die mitochondrialen Membranpotentiale bestimmt sowie intrazelluläre reaktive Sauerstoffverbindungen quantifiziert werden. Schließlich soll die Stoffwechselaktivität der RV-infizierten Zellen gemessen und in diesem Zusammenhang insbesondere die Glykolyserate und die Sauerstoffkonsumtion der Zellen ermittelt werden. In einem dritten Teilprojekt soll schließlich bestimmt werden, welche Folgen eine RV-Infektion auf die Differenzierungsfähigkeit von hES-Zellen im Rahmen von embryoid bodies (EBs) hat. Hierbei soll zum einen die Effektivität der EB-Bildung bestimmt werden, zum anderen soll die Expression von Markergenen für Zellen der  drei Keimblätter im EB quantifiziert werden, um Rückschlüsse auf mögliche Interferenz der RV-Infektion mit der frühen Differenzierung im EB ziehen zu können.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung von Kenntnissen bei der Entwicklung diagnostischer, präventiver oder therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Die Infektion mit RV kann während des ersten Drittels der Schwangerschaft in seronegativen Frauen zu starken Schädigungen des Embryos bzw. zum Abort führen. Derzeit bestehen jedoch nur unzureichende Kenntnisse  über die molekularen und zellulären Ursachen der embryopathischen Wirkungen von RV. Bekannt ist u. a., dass in somatischen Zellen insbesondere die Mitochondrienfunktion infolge einer RV-Infektion Veränderungen unterliegt. Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist es, einen möglichen Zusammenhang zwischen den teratogenen Wirkungen einer RV-Infektion und der durch RV-Infektion veränderten Mitochondrienfunktion und damit molekulare Grundlagen der RV-induzierten Teratogenität aufzuklären.

Durch die Etablierung der RV-Infektion in hES-Zellen und die Optimierung der Bedingungen für diese Infektion sollen Erkenntnisse darüber gewonnen werden, ob hES-Zellen permissiv für eine RV-Infektion sind, ob die RV-Infektion die Vitalität und das Wachstum von hES-Zellen beeinträchtigt, ob sich das Genexpressionsmuster der hES-Zellen verändert und ob sich die für RV-Infektion typischen Veränderungen in der intrazellulären Lokalisation der Mitochondrien auch in hES-Zellen beobachten lassen. Ferner soll untersucht werden, ob bereits bekannte Interferenzen zwischen Mitochondrien und RV auch in hES-Zellen auftreten. Diese Frage ist aufgrund des im Vergleich zu somatischen Zellen nur geringen oxydativen Stoffwechsels in hES-Zellen sowie aufgrund der deutlichen Unterschiede in der Morphologie, im Reifegrad und in der Lokalisation der Mitochondrien von besonderem Interesse. Hierbei werden Erkenntnisse darüber angestrebt, ob bekannte Interaktionen von viralen Proteinen und Mitochondrienkomponenten auch in hES-Zellen auftreten und welche mitochondrialen Eigenschaften infolge dieser Wechselwirkungen möglicherweise beeinträchtigt sind. Dabei könnten ggf. wesentliche Erkenntnisse über die Rolle bestimmter mitochondrialer Funktionen in hES-Zellen, dem In-vitro-Äquivalent frühembryonaler menschlicher Zellen, erzielt und daraus ggf. Rückschlüsse auf Prozesse der frühen Embryonalentwicklung des Menschen gezogen werden. Schließlich soll im Rahmen des genehmigten Forschungsvorhabens analysiert werden, ob und inwieweit die Etablierung einer RV-Infektion die frühe Differenzierung von hES-Zellen beeinträchtigt. Dies ist besonders im Hinblick auf die durch RV ausgelöste Embryopathie von wesentlichem Interesse. Eine RV-Infektion kann beispielsweise zu teils schweren Schädigungen des Zentralnervensystem und des Herzens führen. Da eine RV-Infektion besonders starke embryoschädigende Wirkungen haben kann, wenn sie im Frühstadium der Schwangerschaft etabliert wird, ist die Hypothese plausibel, dass bereits frühe zelluläre Differenzierungsprozesse, wie sie im EB in vitro nachgebildet werden können, beeinträchtigt werden. Zudem erfolgt im Laufe der frühen Differenzierung von hES-Zellen eine Umstellung des zellulären Energiestoffwechsels von überwiegender Glykolyse hin zur oxydativen Phosphorylierung. Damit verbunden sind eine Veränderung in der Morphologie und Lokalisation sowie ein Funktionszugewinn der Mitochondrien. Eine Interferenz von RV mit bestimmten Mitochondrienkomponenten könnte, wenn sie die Funktion der Mitochondrien beeinträchtigt, somit erhebliche Konsequenzen für den Energiestoffwechsel der Zellen und damit für die Differenzierung von hES-Zellen haben.

Insgesamt  könnte auf Grundlage der aus dem Forschungsvorhaben erwarteten Erkenntnisse ein relevantes Zellmodell für die Untersuchung der teratogenen Wirkungen von RV etabliert werden. Darüber hinaus könnten durch die Untersuchung spezifischer Wechselwirkungen zwischen RV-Proteinen und mitochondrialen Komponenten Erkenntnisse über die Rolle der Mitochondrien und ihrer Bestandteile für die Aufrechterhaltung eines pluripotenten Stadiums von hES-Zellen sowie für frühe zelluläre Differenzierungsprozesse  gewonnen werden.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Die Infektion mit RV wurde in der Vergangenheit umfangreich in humanen und nicht-humanen Zellkultursystemen untersucht. In eigenen Vorarbeiten hat die Genehmigungsinhaberin zudem erfolgreich ein Infektionsmodell für RV unter Verwendung von hiPS-Zellen etabliert. Dies legt nahe, dass auch hES-Zellen einer Infektion mit RV zugänglich sind. Ferner wurden die Ergebnisse fremder und eigener Vorarbeiten zur Wechselwirkung von RV-Proteinen mit mitochondrialen Proteinen und deren Konsequenzen für die Funktion und Lokalisation der Mitochondrien dargelegt. So interagiert das virale Capsid-Protein beispielsweise mit dem mitochondrialen Protein p32, was zu einer Umverteilung der Mitochondrien in der Zelle hin zu den Orten der Virusreplikation führt. Zudem bewirkte eine RV-Infektion eine deutliche Aktivierung des Elektronentransportkettenkomplexes III und eine Erhöhung des mitochondrialen Membranpotentials. Insofern bestehen begründete Anhaltspunkte dafür, dass eine RV-Infektion und die damit verbundenen Wechselwirkungen zwischen den Mitochondrien infizierter Zellen und RV-Proteinen auch für die Aktivität und Funktion von Mitochondrien in hES-Zellen relevant sein könnten, was die Untersuchung dieser Frage unter Verwendung von hES-Zellen rechtfertigt. Das von der Antragstellerin zur Nutzung vorgesehene Differenzierungsmodell für hES-Zellen im EB sowie die Methoden zum Nachweis der Differenzierung von hES-Zellen in Derivate der verschiedenen Keimblätter sind seit langem in der Literatur beschrieben.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Etablierung einer RV-Infektion an tierischen Zellen ist zwar möglich, jedoch konnte bislang kein Tiermodell für RV etabliert werden, in dem die für eine RV-Infektion beim Menschen charakteristischen embryoschädigenden Wirkungen beobachtet werden konnten. Es ist daher nicht davon auszugehen, dass Zellmodelle tierischer Herkunft geeignet sind, die molekularen Ursachen für die embryopathischen Effekte einer RV-Infektion zu ergründen.  Hierzu werden humane Zellen benötigt.

Der Schwerpunkt der geplanten Untersuchungen liegt in der Analyse von erwarteten Veränderungen in der Mitochondrienfunktion infolge einer RV-Infektion. Im Zusammenhang damit soll die mögliche Beeinträchtigung früher menschlicher Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse durch das RV untersucht werden. Diese Untersuchungen erfordern die Verwendung humaner pluripotenter Stammzellen. Humane pluripotente Stammzellen weisen einen Energiestoffwechsel auf, der sich deutlich von jenem somatischer (Stamm)Zellen unterscheidet. Während hES-Zellen ihren Energiebedarf zum allergrößten Teil durch Glykolyse decken, ist bereits mit frühen Differenzierungsprozessen ein Übergang zur oxydativen Phosphorylierung zu beobachten. Dies geht mit einer Veränderung in der Morphologie, im Reifegrad und in der Lokalisation der Mitochondrien während der Differenzierung einher. Die Untersuchung der Fragestellung, ob die molekularen Ursachen der teratogenen Wirkungen von RV bereits kurz nach Etablierung der Schwangerschaft ggf. durch dessen Wechselwirkung mit den Mitochondrien der infizierten Zellen bedingt werden, lässt sich angesichts dieser Unterschiede nicht an anderen als humanen pluripotenten Zellen klären. Zudem soll im genehmigten Forschungsvorhaben bestimmt werden, ob die RV-Infektion bereits in frühesten Embryonalstadien etabliert werden kann und dadurch frühe zelluläre Differenzierungsprozesse, wie sie im EB in vitro nachgebildet werden, beeinträchtigt werden. Diese Frage kann unter Nutzung anderer Typen von Stammzellen, die diese frühen Differenzierungsprozesse bereits durchlaufen haben, nicht geklärt werden.

Die im Antrag formulierten Forschungsziele sind voraussichtlich auch nicht unter ausschließlicher Nutzung von hiPS-Zellen zu erreichen. Zwar wurde bereits gezeigt, dass bei der Reprogrammierung somatischer Zellen auch die Mitochondrien in einen weniger reifen Zustand zurückversetzt werden. Jedoch wurden signifikante Unterschiede zwischen den Mitochondrien von hES- und hiPS-Zellen festgestellt. Diese betreffen beispielsweise die Expression von Genen, die im Zusammenhang mit dem Glukosestoffwechsel stehen, die Sauerstoffkonsumptionsrate oder – nach Differenzierung in Fibroblasten – die Menge an antioxidativ wirksamen Enzymen. Zudem bestehen Unterschiede in der Morphologie und Ultrastruktur der Mitochondrien von hES- und hiPS-Zellen. Es kann folglich nicht ohne weiteres davon ausgegangen werden, dass in hiPS-Zellen dieselben mitochondrialen Interaktionen mit RV wie in hES-Zellen auftreten und dass aus dem Verhalten von hiPS-Zellen nach RV-Infektion auf die entsprechenden Eigenschaften von hES-Zellen geschlossen werden kann.

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