66. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Herr Prof. Dr. Ezio Bonifacio, Technische Universität Dresden

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HS181 (Karolinska-Institut, Göteborg, Schweden)
• HS401 (Karolinska-Institut, Göteborg, Schweden)
• HS415 (Karolinska-Institut, Göteborg, Schweden)
• HUES8 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)

Die Genehmigung gilt auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten soll in einem ersten Teilprojekt eine effiziente Methode zur In-vitro-Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) zu insulinproduzierenden pankreatischen β-Zellen etabliert werden. Dazu sollen hES-Zellen zunächst in Zellen des definitiven Entoderms differenziert und diese dann im Kontext eines dreidimensionalen Kultursystems zu insulinproduzierenden inselartigen Strukturen weiterentwickelt werden, wobei insbesondere das Auftreten möglicher spezifischer pankreatischer Vorläuferzell-Populationen untersucht werden soll. Die im dreidimensionalen System hergestellten insulinproduzierenden inselartigen Strukturen sollen dann in ein immundefizientes diabetisches Mausmodell transplantiert und die Funktionsfähigkeit sowie das Überleben der Transplantate eingehend analysiert werden. In einem zweiten Teilprojekt soll untersucht werden, ob die gemeinsame Transplantation von aus hES-Zellen gewonnenen inselartigen Strukturen mit mesenchymalen Stammzellen (MSCs) des Knochenmarks zu einer verbesserten Funktionalität und einer erhöhten Vitalität der Transplantate führt. Insbesondere soll geklärt werden, ob und in welchem Maße der erwartete positive Effekt der zusätzlichen Transplantation von MSCs auf eine verminderte Apoptoserate der transplantierten pankreatischen Zellen, eine verbesserte Vaskularisierung des Transplantates, eine verstärkte Vermehrung der transplantierten pankreatischen Zellen und/oder eine Verminderung der mit der Transplantation verbundenen entzündlichen Vorgänge rückführbar ist. Alle Untersuchungen sollen auch unter Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) durchgeführt werden, wobei hES-Zellen hier zu Vergleichszwecken genutzt werden sollen.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung von Kenntnissen bei der Entwicklung diagnostischer, präventiver oder therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist zunächst die Weiterentwicklung von In-vitro-Differenzierungsprotokollen zur Gewinnung potentiell transplantierbarer, insulinproduzierender inselartiger pankreatischer Strukturen des Menschen. Dabei sollen bereits in zweidimensionalen Kulturen etablierte Differenzierungsprotokolle auf die Differenzierung in dreidimensionalen Kultursystemen übertragen werden. Durch dieses Vorgehen sollen die natürliche Nische für die Entwicklung der verschiedenen Typen pankreatischer Zellen in vitro nachgebildet, dadurch eine korrekte Entwicklung der pankreatischen Zellen ermöglicht und auf diesem Wege u. a. neue Erkenntnisse über die Rolle von Zell-Zell-Wechselwirkungen während der pankreatischen Differenzierung beim Menschen gewonnen werden. Ferner sollen während der pankreatischen Differenzierung auftretende Vorläuferzelltypen genauer als bislang charakterisiert und ggf. angereichert werden. Aus diesen Erkenntnissen können ggf. auch Rückschlüsse auf Vorgänge bei der Entwicklung des menschlichen Pankreas sowie bei der Neogenese und Regeneration von β-Zellen gezogen werden.

Im weiteren Verlauf des Forschungsvorhabens soll dann die Eignung der in vitro hergestellten inselartigen Strukturen für die Transplantation in diabetische Mäuse untersucht und insbesondere der Effekt kotransplantierter MSCs auf die Überlebensfähigkeit sowie auf die Funktionalität der Transplantate analysiert werden. Von einer gemeinsamen Transplantation der inselartigen Strukturen und MSCs wird eine verbesserte Überlebensrate des insulinproduzierenden Transplantates erwartet, da entsprechende Effekte bereits in der Vergangenheit beobachtet worden waren. Die Experimente sollen Aufschluss über die molekularen und zellbiologischen Grundlagen dieses Phänomens erbringen, insbesondere darüber, ob und auf welchem Wege MSCs die Apoptose in den Zellen des insulinproduzierenden Transplantates vermindern und zur Erhaltung der Architektur und funktionellen Integrität der transplantierten inselartigen Strukturen beitragen können. Dies könnte ggf. auch zu einem besseren Verständnis der Rolle von MSCs bei der (natürlichen) Regeneration des Pankreas, insbesondere der insulinproduzierenden β-Zellen, beitragen.

Mittelfristiges Ziel der Untersuchungen ist die Schaffung von Grundlagen für eine Gewebeersatztherapie des Diabetes mellitus, insbesondere die Entwicklung neuer Kotransplantations-Protokolle. Diesem Ziel dienen sowohl die Etablierung optimierter Differenzierungsprotokolle zur Gewinnung transplantierbarer menschlicher pankreatischer Inseln als auch die Untersuchung der Rolle von MSCs für das Überleben und die Funktion entsprechender Transplantate. Die geplante vergleichende Untersuchung von hESCs und hiPSCs kann darüber hinaus klären helfen, ob beide Zelltypen ein vergleichbares pankreatisches Differenzierungspotential aufweisen, ob auf dem jeweiligen Zelltyp basierende inselartige Strukturen sich nach Transplantation in geeignete Mausmodelle unter dem Einfluss kotransplantierter MSCs identisch verhalten und ob folglich beide Zelltypen in gleicher Weise als Ausgangspunkt für künftig vorstellbare Gewebeersatz-Therapien geeignet sind.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Protokolle für die Differenzierung sowohl muriner als auch humaner ES-Zellen in Richtung pankreatischer β-Zellen in zweidimensionalen Kultursystemen sind in der Vergangenheit etabliert und publiziert worden. Beim Genehmigungsinhaber wurden darüber hinaus murine ES-Zellen bereits im Kontext eines dreidimensionalen Kultursystems erfolgreich in inselartige Strukturen differenziert, die pankreatische β-Zellen enthielten.

Zur Frage nach der Rolle von MSCs bei der Regeneration des Pankreas bzw. auf das Überleben von transplantierten pankreatischen Inseln wurden in der Vergangenheit ebenfalls umfangreiche Untersuchungen im Maussystem durchgeführt, teils unter Beteiligung des Genehmigungsinhabers. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass im Pankreas residierende MSCs mit hoher Wahrscheinlichkeit ihren Ursprung im Knochenmark haben und offenbar eine „Helferfunktion“ bei der Regeneration des Pankreas erfüllen, vermutlich infolge parakriner Effekte. Ferner wurde gezeigt, dass die Kotransplantation einer geringen Anzahl (muriner) pankreatischer Inseln und (muriner) MSCs zur Wiederherstellung einer normoglykämischen Situation in diabetischen Mäusen führte, was mit einer verstärkten Vaskularisierung des Transplantates verbunden war.

Die im Forschungsvorhaben geplanten experimentellen Vorgehensweisen, beispielsweise zum Monitoring des Differenzierungsprozesses, zur Überprüfung des Differenzierungserfolges, zur Transplantation von pankreatischen Inseln in diabetische Mäuse oder zur Charakterisierung der Transplantate nach deren Explantation, sind hinreichend bekannt.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Gegenstand der beantragten Arbeiten ist die Etablierung von Differenzierungsprotokollen für pankreatische Inseln aus hES-Zellen auch mit dem Ziel, ausreichende Mengen differenzierter Zellen für künftige Gewebeersatztherapien bereitstellen zu können. Dies erfordert die Verwendung humaner Zellen. Die Etablierung entsprechender Protokolle unter Verwendung von Zellen anderer Spezies als Ausgangsmaterial ist nicht zielführend, da nicht davon ausgegangen werden kann, dass die Differenzierungsprotokolle für beispielsweise murine ES-Zellen ohne eine experimentelle Überprüfung im humanen System auf den Menschen übertragen werden könnten.

Die Durchführung des Projektes erfordert darüber hinaus die Nutzung humaner embryonaler Stammzellen. Zum einen ist die Frage nach den zellulären Quelle(n) für das sich regenerierende Pankreas trotz intensiver Forschungen weiterhin strittig. Pankreatische Vorläuferzellen konnten in vitro bislang nicht in funktionstüchtige Inselzellen differenziert werden. Ferner konnte zwar gezeigt werden, dass sich bestimmte Zelltypen (beispielsweise Epithelzellen des Pankreasganges) in vivo in endokrine pankreatische Zellen differenzieren können. Dies konnte in vitro jedoch bislang nicht nachvollzogen werden. Auch das Konzept der Transdifferenzierung verschiedener Typen adulter Stammzellen, beispielsweise von MSCs, in insulinproduzierende pankreatische Zellen ist strittig. Die Ergebnisse der Forschungen des Genehmigungsinhabers weisen darauf hin, dass MSCs eher eine unterstützende Funktion bei der Pankreasregeneration haben als dass sie Ausgangspunkt für die Bildung insulinproduzierender Zellen sind. Auf die Nutzung humaner Zellen fötalen Ursprungs kann aufgrund des Fehlens experimenteller Belege für ihre In-vitro-Differenzierbarkeit zu pankreatischen Zellen zur Erreichung der Forschungsziele ebenfalls nicht verwiesen werden.

Die Forschungsziele sind auch nicht durch eine ausschließliche Verwendung von hiPS-Zellen zu erreichen. Zum einen liegen bislang nur singuläre Ergebnisse darüber vor, dass sich hiPS-Zellen zu insulinproduzierenden pankreatischen Zellen differenzieren lassen. Zum anderen soll im beantragten Projekt unter vergleichender Verwendung von hES-Zellen das pankreatische Differenzierungspotential humaner iPS-Zellen erst untersucht und die Frage geklärt werden, ob und inwieweit hier Unterschiede zwischen beiden Typen pluripotenter Zellen bestehen. Die Nutzung von hES-Zellen ist daher erforderlich.

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