63. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Frau Prof. Dr. Beate Winner, Universitätsklinikum Erlangen

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H7 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HUES6 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• NCL-3 (Newcastle Fertility Centre, Newcastle upon Tyne, Großbritannien)
• NCL-4 (Newcastle Fertility Centre, Newcastle upon Tyne, Großbritannien)

Die Genehmigung gilt auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen im Rahmen der Durchführung eines Projektes, das sich in zwei Teile gliedert. Gegenstand des ersten Projektteils ist die Etablierung und Optimierung von Protokollen für die Gewinnung kortikospinaler Motoneuronen (corticospinal motor neurons, CSMNs). Ziel der Arbeiten ist die Bereitstellung eines auf humanen Zellen basierenden Modellsystems, anhand dessen degenerative Motoneuronenerkrankungen, wie beispielsweise die amyotrophe Lateralsklerose (ALS) oder die hereditäre spastische Spinalparalyse (HSP), untersucht werden können. Hierzu soll ein Protokoll für die effiziente Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in CSMNs erarbeitet und die gewonnenen Zellen bezüglich ihrer biochemischen, molekularen und funktionellen Eigenschaften umfassend in vitro charakterisiert werden. Im Anschluß daran sollen (mutierte) Gene, die eine Rolle bei der Pathogenese degenerativer Motoneuronenerkrankungen spielen, in den aus hES-Zellen gewonnenen Neuronen überexprimiert und damit ein Modell bereitgestellt werden, an dem ggf. die Pathogenese der jeweiligen Erkrankung untersucht werden kann. Schwerpunkt des zweiten Projektteiles ist die Untersuchung der Fragestellung, ob und inwieweit sich hES- Zellen und hiPS-Zellen bezüglich ihres Differenzierungspotentials in spezifische Typen neuraler Zellen gleichen bzw. unterscheiden. Dazu sollen hES-Zellen und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) parallel in verschiedene neurale Zelltypen, wie beispielsweise dopaminerge oder cholinerge Neuronen oder Astrozyten, differenziert und die entstehenden Zellpopulationen charakterisiert werden. Für die vergleichenden Untersuchungen sollen sowohl hiPS-Zellen aus gesunden als auch aus von Motoneuronenerkrankungen betroffenen Patienten genutzt werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Im genehmigten Projekt sollen Protokolle für die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen in Richtung kortikospinaler Motoneuronen etabliert werden und diese auf ihre Eignung zur Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen untersucht werden. Ziel ist die Gewinnung möglichst reiner Populationen dieses Zelltyps sowie ggf. die Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von Vorläuferzellen kortikospinaler Motoneuronen. Die geplantem Arbeiten können dazu beitragen, den bislang wenig verstandenen Differenzierungsweg von der pluripotenten Stammzellen bis hin zum postmitotischen kortikospinalen Motoneuron in vitro nachzubilden und dabei Moleküle und Signalwege zu identifizieren, die an dieser Differenzierung beteiligt sind. Derzeit ist beispielsweise nicht geklärt, ob die Determinierung für kortikospinale Motoneuronen bereits in sich entwickelnden neuralen Vorläuferzellen erfolgt, zu welchem Zeitpunkt der Entwicklung die Segregation kortikospinaler Motoneuronen von anderen Projektionsneuronen beobachtet werden kann und welche Signale für eine differentielle Spezifizierung in verschiedene Typen von Projektionsneuronen verantwortlich sind. Durch die Klärung dieser offenen Fragen könnten die geplanten Arbeiten wesentliche Beiträge zu einem verbesserten Verständnis der Genese des Kortex während der menschlichen Embryonalentwicklung leisten.

Die Entwicklung von Differenzierungsprotokollen für die Bereitstellung humaner kortikospinaler Motoneuronen erfolgt mit der Zielsetzung, dadurch ein humanes Zellmodell für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen bereitzustellen. Allein die Verfügbarkeit relativ reiner Populationen von kortikospinalen Motoneuronen könnte von großem Nutzen sein, um beispielsweise Substanzen mit potentiell therapeutischer Wirkung auf die Differenzierung, die Vitalität oder die Konnektivität dieses Typs neuronaler Zellen sowie auf die zelltypspezifische Genexpression hin untersuchen zu können. Krankheitsspezifische kortikospinale Motoneuronen könnten zudem zur Identifizierung krankheitsspezifischer Signalwege sowie von potentiell therapeutischen Substanzen genutzt werden. Dies könnte zu einem vertieften Verständnis der Pathogenese degenerativer Erkrankungen der Motoneuronen und ggf. zur Entwicklung neuer Therapieoptionen beitragen.

Durch vergleichende Differenzierung von hES- und hiPS-Zellen in verschiedene Typen neuraler Zellen soll ferner Aufschluss darüber gewonnen werden, ob und inwieweit beide Typen humaner pluripotenter Stammzellen gleichermaßen für die Generierung spezifischer neuraler Zelltypen, beispielsweise cholinerger oder dopaminerger Neurone, geeignet sind. Neben verbesserten Differenzierungsprotokollen sollen diesen Untersuchungen zu Erkenntnissen über das jeweilige spezifische Differenzierungspotential von hiPS-Zellen führen. Das Vorliegen eines umfassenden neuronalen Differenzierungspotentials von hiPS-Zellen ist wiederum Voraussetzung für die Nutzung patienteneigener hiPS-Zellen als Ausgangsmaterial für die Gewinnung krankheitsspezifischer neuronaler Zellen, beispielsweise von kortikospinalen Motoneuronen aus Patienten mit ALS, denen ein hohes Potential für die Untersuchung von Pathogeneseprozessen auf zellulärer Ebene sowie für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für diese Erkrankungen zugeschrieben wird.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Protokolle für die Differenzierung von murinen ES-Zellen zu kortikalen Projektionsneuronen wurden in der Vergangenheit etabliert. Die geplanten Vorgehensweisen zur Gewinnung kortikospinaler Motoneuronen basieren auch auf neuen entwicklungsbiologischen Erkenntnissen zur Entstehung kortikaler Neuronen in der Maus, beispielsweise zur Expression der Gene für bestimmte Transkriptionsfaktoren in spezifischen Stadien der Entwicklung von Projektionsneuronen, die im Antragsverfahren dargelegt wurden.

Hinsichtlich der geplanten vergleichenden Differenzierung von hES-Zellen und hiPS-Zellen in verschiedene Zelltypen des ZNS wurde dargelegt, dass in der Vergangenheit zahlreiche Protokolle für die Differenzierung von hES-Zellen in diverse neurale Zelltypen etabliert und veröffentlicht worden sind. Hier liegt folglich bereits ein gesicherter Erkenntnisstand zu hES-Zellen vor, der im zweiten Projektteil auch in Bezug auf hiPS-Zellen angestrebt wird, wobei die Differenzierungsprotokolle mit dem Ziel einer verbesserten Effizienz modifiziert, kombiniert und optimiert werden sollen.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Ziel der genehmigten Arbeiten ist die Etablierung eines Zellmodells auf der Grundlage humaner kortikospinaler Motoneuronen, das zur Untersuchung humaner neurodegenerativer Erkrankungen genutzt werden soll. Dabei sollen Erkenntnisse über Moleküle und Signalwege gewonnen werden, die bei der Entstehung und Reifung kortikospinaler Motoneuronen eine Rolle spielen. Zwar sind bestimmte Prozesse bei der Entstehung und Reifung des ZNS entwicklungsbiologisch konserviert, jedoch lassen sich Erkenntnisse zur Nervenzellentwicklung tierischer Spezies nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragen, sondern müssen jeweils im humanen System verifiziert werden. Es bestehen teils deutliche Unterschiede in den metabolischen und physiologischen Eigenschaften beispielsweise muriner und humaner Zellen, die zu erheblichen Differenzen in der zellulären Kommunikation oder in der Empfindlichkeit gegenüber schädigenden Noxen führen. Es ist folglich nach derzeitigem Kenntnisstand nicht davon auszugehen, dass sich Zellen aus anderen Spezies in gleicher Weise für die Untersuchung der Differenzierung von Nervenzellen im Menschen sowie neurodegenerativer Erkrankungen eignen wie humane Zellen.

Voraussetzung für eine erfolgreiche Durchführung des Projektes ist die Verfügbarkeit von Zellen, die möglichst weitgehend primären humanen neuralen Zellen gleichen, in ausreichender Menge und reproduzierbarer Qualität verfügbar sind und eine geringe genetische Variabilität aufweisen. Derartige Zellen können nach gegenwärtigem Kenntnisstand aber nicht aus anderen als hES-Zellen gewonnen werden. Primäre humane Nervenzellen, insbesondere kortikospinale Neuronen, lassen sich derzeit nicht oder nicht in für die Projektdurchführung notwendiger Qualität und Menge gewinnen. Etablierte (i. allg. aus Neuroblastomen abgeleitete) neurale Zellen bilden nur kurze Fortsätze und ähneln in physiologischen Parametern nur sehr bedingt humanen Nervenzellen. Neurale (Vorläufer)Zellen aus abgetriebenen Föten könnten theoretisch zwar für bestimmte Fragestellungen des Projektes genutzt werden wie beispielsweise zur Untersuchung von Reifungsprozessen entsprechend determinierter Vorläuferzellen zu kortikospinalen Motoneuronen. Diese Zellen haben aber bereits bestimmte frühe Determinierungsprozesse durchlaufen,  die im beantragten Forschungsvorhaben aufgeklärt werden sollen. Zudem sind auch diese Zellen nicht in reproduzierbarer Qualität und in ausreichenden Mengen verfügbar.

Die Forschungsziele sind ferner auch nicht durch eine ausschließliche Verwendung von hiPS-Zellen zu erreichen. Zum einen ist derzeit nicht bekannt, ob sich hiPS-Zellen überhaupt zu kortikospinalen Motoneuronen differenzieren lassen; über murine iPS-Zellen liegen hierzu ebenfalls keine Erkenntnisse vor. Zum anderen soll im vorliegenden Projekt unter vergleichender Verwendung von hES-Zellen das neuronale Differenzierungspotential humaner iPS-Zellen durch Differenzierung in spezifische Zelltypen des ZNS erst untersucht und die Frage geklärt werden, ob und inwieweit hier Unterschiede zwischen diesen beiden Typen pluripotenter Zellen bestehen. Dies kann nicht alleine unter Verwendung von hiPS-Zellen erreicht werden, sondern erfordert auch die Nutzung von hES-Zellen.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 25.08.2016

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Im Zuge der Durchführung von Forschungsarbeiten unter Nutzung Patienten-spezifischer hiPS-Zellen konnte gezeigt werden, dass hiPS-Zellen aus Patienten mit Spastischer Paraplegie 11 (SPG11, eine komplexe Variante von HSP) u. a. eine verminderte Proliferation neuraler Vorläuferzellen aufwiesen, die mit einer Störung im Wnt-GSK3-beta-Signalweg in Zusammenhang steht. Ursächlich für SPG11 sind Mutationen im SPG11-Gen, das für Spatacsin codiert, wobei die genauen Funktionen von Spatacsin nicht bekannt sind. Angesichts auch weiterer Defekte in der neuralen Differenzierung von SPG11-hiPS-Zellen soll nun geklärt werden, auf welche Weise eine veränderte Funktion von Spatacsin mit einer veränderten Aktivität des Wnt-GSK3-beta-Signalweges in Zusammenhang steht. Mögliche Kandidaten für die Vermittlung der Wechselwirkungen zwischen Spatacsin und dem Wnt-GSK3-beta-Signalweg sollen durch genomische Editierung der entsprechenden Gene, Etablierung genetisch stabil veränderter hES-Zell-Klone sowie umfassende Charakterisierung der genetisch veränderten Zellen nach Differenzierung in Neuronen verschiedener Neurotransmitterphänotypen identifiziert werden. Ziel der Arbeiten ist u. a. die Identifizierung von Genen, deren Expression oder epigenetische Konformation infolge des Editierens der genannten Gene verändert ist und deren Produkte möglicherweise Downstream-Effekte von Spatacsin und anderen interessierenden Genen bewirken oder Wechselwirkungen zwischen Spatacsin und dem Wnt-GSK3-beta-Signalweg vermitteln. Gegebenenfalls sollen solche im Forschungsvorhaben identifizierten Gene ebenfalls  editiert und die Effekte auf die aus den entsprechenden Zellen differenzierten neuralen Zellen bestimmt werden.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Die genehmigten Forschungsarbeiten zielen auf die Klärung von Fragen nach molekularen Ursachen neurodegenerativer Erkrankungen des Menschen, die unter Nutzung von aus pluripotenten Stammzellen des Menschen abgeleiteten Zellmodellen erfolgen soll. Diese Arbeiten werden nun um Arbeiten zum editing von Genen mit Relevanz für die Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen ergänzt, wobei der Schwerpunkt nunmehr auf der Untersuchung molekularer Veränderungen infolge von Mutationen im SPG11-Gen liegen, die eine der häufigsten autosomal-rezessiven hereditären spastischen Paraplegien ist. In Arbeiten unter Nutzung von hiPS-Zellen aus Patienten mit SPG11 ist bereits gezeigt worden, dass aus diesen Zellen abgeleitete neurale Vorläuferzellen eine transkriptionelle Dysregulation, eine verminderte Proliferationsrate, verbunden mit einer veränderten Regulation des Zellzyklus, sowie Differenzierungsdefizite aufwiesen. Zudem haben sich Hinweise auf die molekularen Grundlagen dieser Effekte ergeben, die nun vertieft untersucht werden sollen. Dies betrifft beispielsweise die Wechselwirkungen zwischen Mutationen im SPG11-Gen sowie dem damit einhergehenden Funktionsverlust von Spatacsin und der veränderten Regulation im wnt3/GSK3-beta/beta-Catenin-Signalweg bei neuraler Differenzierung. Dabei könnten ggf. Gene identifiziert werden, deren Produkte mit dem GSK3-beta/beta-Catenin-Signalweg in Zusammenhang stehen und möglicherweise von Relevanz für die bei SPG11 auftretenden neuralen Veränderungen sind. Die genehmigten Forschungsarbeiten können aller Voraussicht nach einen Beitrag zur Aufklärung von molekularen Pathogenesemechanismen bei SPG11 leisten, darüber hinaus aber auch zum Verständnis der Dysregulation von neuraler Differenzierung beim Menschen insgesamt beitragen.

Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Genehmigungsverfahren wurde u. a. auf eigene jüngst publizierte Arbeiten zur Dysregulation der Neurogenese bei SPG11 verwiesen. Daraus ergibt sich insbesondere ein klarer Zusammenhang zwischen dem funktionellen knock out von Spatacsin und der Dysregulation der Genese kortikaler Neurone sowohl in der Maus als auch im Menschen. Die Korrelation von Mutationen im SPG11-Gen und einer veränderten Regulation des  GSK3-beta/beta-Catenin-Signalweges ist klar belegt, so dass die spezifische Fragestellung des Vorhabens, die molekularen Grundlagen für diesen Zusammenhang aufzuklären, hinreichend vorgeklärt ist. Die experimentellen Vorgehensweisen sind durch die Verfügbarkeit effizienter Methoden für das genome editing sowie für die Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in verschiede Typen neuraler Zellen gegeben.

Die im ursprünglichen Antragsverfahren vorgetragenen Argumente zur Notwendigkeit der Ver­wendung von hES-Zellen, insbesondere hinsichtlich der denkbaren Erreichbarkeit der Forschungsziele unter Nutzung tierischer und anderer humaner Zelltypen als pluripotenter Stammzellen, gelten unverändert fort. Gegen eine mögliche alleinige Verwendung von hiPS-Zellen zur Erreichung der Forschungsziele spricht die Tatsache, dass die Genehmigungsinhaberin derzeit deutliche Hinweise darauf hat, dass die beobachtete Dysregulation der Neurogenese bei SPG11 mit Faktoren in Zusammenhang stehen kann, die vor allem auf der Ebene des Epigenoms wirken. Studien zu möglichen molekularen Grundlagen der Regulation auf der Ebene des Epigenoms erfordern aber Zellen mit einem ursprünglichen Epigenom, das in der Vergangenheit keine artifiziellen Veränderungen erfahren hat. Diese Voraussetzungen erfüllen hiPS-Zellen nicht; es ist nach wie vor ungeklärt, ob in hiPS-Zellen ein zu hES-Zellen identisches Epigenom vorliegt. Zahlreiche Hinweise auf ein epigenetisches Gedächtnis von hiPS-Zellen legen nahe, dass die Reprogrammierung zumindest in vielen Fällen unvollständig ist und zu einem Epigenom führt, dass nicht vollständig jenem von embryonalen Stammzellen entspricht. Insofern ist für die Erreichung der Forschungsziele die Verwendung von hES-Zellen erforderlich.

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