55. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Medizinische Hochschule Hannover

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• I3 (Technion, Haifa, Israel)
• I4 (Technion, Haifa, Israel)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-4 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HUES8 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)

Im Rahmen der Erweiterung der Genehmigung vom 31.10.2012 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen der folgenden weiteren Linie genehmigt:

• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten ist die vergleichende Untersuchung der Glykosylierungsmuster in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) und humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen). Dazu sollen die Zellen zunächst unter Standard-Kulturbedingungen bezüglich ihrer Glykoproteine und Glykolipide analysiert und hinsichtlich der Präsenz assoziierter Proteine und Lipide miteinander verglichen werden. Da ein erheblicher Einfluss der Kulturbedingungen auf das Glykosylierungsmuster beider Arten pluripotenter Zellen erwartet wird, soll anschließend untersucht werden, ob und auf welche Weise sich die Glykosylierungsmuster der Zellen unter modifizierten Kulturbedingungen, beispielsweise in Suspensionskultur, verändern. Schließlich soll überprüft werden, welchen Veränderungen das Glykom, das Proteoglykom und das Proteom beider Arten pluripotenter Zellen im Verlauf der Differenzierung zu Kardiomyozyten unterliegen und ob im Ergebnis des Differenzierungsprozesses eine zu menschlichen Herzmuskelzellen vergleichbare Glykosylierung vorliegt.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung von Kenntnissen bei der Entwicklung diagnostischer, präventiver oder therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Gegenstand des genehmigten Vorhabens ist es, den Glykosylierungszustand sowie das Proteom von hiPS- und hES-Zellen eingehend zu untersuchen und miteinander zu vergleichen. Dabei soll untersucht werden, ob bei der Reprogrammierung somatischer Zellen zu pluripotenten Zellen Glykosylierungsmuster und Proteome entstehen, die mit denen von hES-Zellen identisch sind. Ferner ist von Interesse, ob hiPS-Zellen, die aus verschiedenen Quellen gewonnen worden sind, bezüglich dieser Eigenschaften untereinander und zu hES-Zellen identisch sind. Durch die Untersuchung mehrerer hES-Zell-Linien sollen zudem Erkenntnisse über eine mögliche Variabilität im Glykosylierungsmuster von hES-Zellen gewonnen werden. Gegebenenfalls können spezifische Eigenschaften bestimmter hES-Zell-Linien mit dem Auftreten eines typischen Glykosylierungsmusters assoziiert werden. Zudem besteht die Möglichkeit der Identifizierung neuer, für hES-Zellen spezifischer Oberflächenmoleküle.

Ferner soll geklärt werden, ob und auf welche Weise Veränderungen der Kulturbedingungen für pluripotente humane Stammzellen mit Veränderungen des Glykoms, des Glykoproteoms sowie des Proteoms einhergehen. Da humane pluripotente Stammzellen sehr spezifische Kulturbedingungen erfordern und für die Kultivierung wesentliche Eigenschaften (z.B. die Fähigkeit zur Herstellung von Zell-Zell bzw. Zell-Matrix-Kontakten) eng mit der Präsenz bestimmter Glykoproteine verbunden sind, ist zu erwarten, dass veränderte Kulturbedingungen auch zu einer Veränderung des Glykoms der Zelle führen. Die Kenntnis über solche Veränderungen kann von Bedeutung für die Etablierung von neuen Kultivierungsprotokollen sein, beispielsweise für die Massenkultur in Suspension oder für die Kultivierung in Bioreaktoren. Eine Kultivierung in größeren als im Labor üblichen Maßstäben ist wiederum Voraussetzung für die Bereitstellung ausreichender Zellmengen, wie sie sowohl für In-vitro-Anwendungen als auch für künftig vorstellbare Gewebeersatztherapien unter Nutzung pluripotenter humaner Stammzellen benötigt würden.

Schließlich soll im beantragten Projekt untersucht werden, auf welche Weise sich das Glykom, das Glykoproteom und das Proteom von pluripotenten humanen Zellen im Verlaufe der kardialen Differenzierung verändern und ob sich hES-Zellen und hiPS-Zellen im Hinblick auf erwartete Veränderungen identisch verhalten. Neben einem grundsätzlichen Erkenntnisgewinn über die Glykosylierung betreffende Vorgänge während der kardialen Differenzierung humaner Zellen sollen durch den Vergleich des Glykoms der differenzierten Zellen mit jenem von adulten Kardiomyozyten (z.B. aus Biopsiematerial) auch Hinweise darauf gewonnen werden, ob die bislang etablierten Differenzierungsprotokolle zu Kardiomyozyten führen, die hinsichtlich ihres Glykoms reifen menschlichen Herzzellen gleichen. Die Analyse des Glykoms während verschiedener Stadien der kardialen Differenzierung (embryoid bodies, kardiale Vorläuferzellen, reife Kardiomyozyten) kann darüber hinaus zur Identifizierung von Glykan-Strukturen führen, die für das jeweilige Differenzierungsstadium spezifisch sind und folglich für die Sortierung und Anreicherung von aus pluripotenten Zellen abgeleiteten kardialen Zellen verwendet werden könnten. Dies ist besonders im Hinblick auf die Tatsache von Bedeutung, dass sowohl In-vitro-Anwendungen als auch künftig vorstellbare Gewebeersatztherapien möglichst reine Populationen von aus pluripotenten humanen Zellen differenzierten Kardiomyozyten erfordern. Zudem lassen sich aus Kenntnissen über Glykoproteine auf der Zelloberfläche ggf. immunologische Eigenschaften von aus hES-Zellen abgeleiteten Zellen besser als bislang beurteilen und Erkenntnisse hinsichtlich der Vermeidung immunologischer Reaktionen ableiten, die im Vorfeld der Entwicklung zelltherapeutischer Verfahren auf der Grundlage von hES- und hiPS-Zellen bedeutsam sein können.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Es wurde dargelegt, dass zahlreiche Studien existieren, die sich mit der Analyse des Glykoms von Säugerzellen, u. a. von Stammzellen der Maus, beschäftigt haben. Es wurde jedoch auch darauf verwiesen, dass sich die Glykosylierungsmuster humaner und tierischer (Stamm)Zellen stark voneinander unterscheiden. Dies zeigt sich bereits in der Präsenz teils unterschiedlicher Glykoproteine auf den Oberflächen muriner und humaner embryonaler Stammzellen. Zudem erfordern embryonale Stammzellen verschiedener Spezies teil erheblich verschiedene Kulturbedingungen. Insofern können inhaltliche Aspekte der hier verfolgten wissenschaftlichen Fragestellungen, wie z.B. der Einfluss der Kulturbedingungen auf das spezifische Glykosylierungsmuster der Zellen, nicht an tierischen Zellen im Sinne eines proof-of-concept vorgeklärt werden.

Allerdings gibt es bereits mehrere Studien, die sich mit der Glykosylierung humaner ES-Zellen befasst haben. So wurde bereits vor mehreren Jahren gezeigt, dass infolge der Kultivierung von hES-Zellen in Medien, die fötales Kälberserum enthielten, die Sialinsäure Neu5Gc, die in menschlichen Zellen nicht synthetisiert wird, in humane ES-Zellen eingebaut wurde. Ferner wurde jüngst gezeigt, dass hES-Zellen ein spezifisches N-Glykom aufweisen, das aus einem konstanten und einem variablen Teil besteht. Ferner ist bekannt, dass die Induktion von Differenzierung in embryoid bodies zu einem massiven Umbau des Glykoms von hES-Zellen führt. Aus diesen Arbeiten ergeben sich wesentliche Erkenntnisse im Sinne einer Vorklärung der Fragestellungen des Projektes, an die durch die nun beantragten Arbeiten angeschlossen werden soll.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Verwendung von hES-Zellen im beantragten Projekt erfolgt mit der Zielstellung, das Glykosylierungsmuster und das Proteom von hiPS-Zellen zu charakterisieren. Dabei sollen im Ergebnis des Projektes Aussagen darüber getroffen zu können, ob die in hiPS-Zellen beobachteten Glykosylierungsmuster mit denen in pluripotenten humanen Stammzellen identisch sind. Dies erfordert einen Vergleich mit authentischen pluripotenten Stammzellen; dies sind nach gegenwärtiger Auffassung allein hES-Zellen.

Da erhebliche Unterschiede in der Glykosylierung von Zellen verschiedener Spezies bestehen, können nicht-menschliche (Stamm)Zellen nicht zu Vergleichszwecken verwendet werden. Andere menschliche (Stamm)Zelltypen kommen für die im beantragten Projekt vorgesehenen vergleichenden Studien ebenfalls nicht in Frage. Adulte humane Stammzellen erfordern andere Kultivierungsbedingungen, zeigen einen von hES-Zellen verschiedenen Besatz mit Glykoproteinen und wären zudem für bestimmte Aspekte des Projektes, beispielsweise die Untersuchung der Glykosylierung während früher Phasen der Differenzierung zu kardialen Zellen, aufgrund ihrer eingeschränkten Differenzierungsfähigkeit nicht geeignet.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 09.08.2016

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Die bereits genehmigten Forschungsarbeiten sollen auch mit dem Ziel durchgeführt werden, Unterschiede in den Oberflächenproteinen bzw. in den Glykosylierungsmustern der Oberflächenproteine der verschiedenen Kardiomyozyten-Subtypen (ventrikuläre, atriale und nodale Kardiomyozyten) zu identifizieren und auf dieser Grundlage zur Etablierung von Protokollen für die Anreicherung spezifischer kardialer Zelltypen beizutragen. Ferner soll analysiert werden, wie sich das Spektrum von sezernierten Proteinen (Sekretom) während der kardialen Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in qualitativer und quantitativer Hinsicht verändert. Weiterhin sollen während der kardialen Differenzierung auftretende (glykosylierte) Oberflächenproteine hinsichtlich ihrer Eignung als Marker für zelluläre Zwischenstadien der kardialen Differenzierung bzw. als Marker für spezifische kardiale Zelltypen im Detail untersucht werden. Dazu sollen entsprechende Expressionsanalysen durchgeführt und die in die Produktion der entsprechenden (Glyko)Proteine involvierten Stoffwechsel- und Signalwege analysiert und ggf. moduliert werden. Ferner sollen mögliche Funktionen sezernierter (Glyko)Proteine und ggf. weiterer Faktoren bei der kardialen Differenzierung untersucht werden. In diesem Zusammenhang soll beispielsweise die Expression von Genen, deren Produkte in spezifischen Phasen der kardialen Differenzierung auftreten, mittels siRNA gehemmt oder über CRISPR/Cas ausgeschaltet oder aber die entsprechenden Gene überexprimiert werden. Mögliche Auswirkungen auf die kardiale Differenzierung, auf die Modulation bestimmter Signalübertragungswege sowie auf das (Glyko)Proteom der Zellen sollen dann bestimmt werden. Die Forschungsarbeiten sollen auch weiterhin im Vergleich zwischen hES-Zellen und hiPS-Zellen durchgeführt werden.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen in erster Linie hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Die genehmigten Forschungsarbeiten stellen eine Weiterentwicklung des bereits in der Vergangenheit genehmigten Forschungsvorhabens dar; die Identifizierung spezifischer Glykosylierungsmuster auf aus hES-Zellen abgeleiteten kardialen Zellen ist weiterhin ein hochrangiges Forschungsziel. Die nun beabsichtigte Charakterisierung von Subtypen von Kardiomyozyten auf der Grundlage (ggf. differentiell glykosylierter) Oberflächenproteine und die darauf aufbauende Entwicklung von Vorgehensweisen für die Anreicherung spezifischer kardialer Zelltypen ist von erheblicher Bedeutung: die gegenwärtig genutzten kardialen Differenzierungsprotokolle führen zu Mischpopulationen von Zellen, während verschiedene Anwendungen aber auf der Nutzung spezifischer kardialer Zelltypen basieren. So werden beispielsweise für Zellersatztherapien vor allem ventrikuläre Kardiomyozyten, für bestimmte pharmakologische Testungen dagegen vorrangig Schrittmacherzellen benötigt. Die genehmigten Forschungsarbeiten zur Analyse der Aktivität von in die Produktion glykosylierter Proteine involvierten Stoffwechselwegen können zudem neue Erkenntnisse über die Regulation biochemischer Prozesse während der kardialen Differenzierung beim Menschen erbringen. Die geplante Untersuchung des Sekretoms sich kardial differenzierender hES-Zellen kann ggf. einen erheblichen Erkenntniszuwachs über von Herzzellen selbst sezernierte (autokrine oder parakrine) Faktoren erbringen, die die kardiale Differenzierung humaner Zellen beeinflussen. Die detaillierte Analyse solcher Faktoren, ihrer Wirkung auf Signalübertragungswege sowie der Konsequenzen der Hemmung oder Überexpression der sie codierenden Gene kann Aufschluss über molekulare Vorgänge während der kardialen Differenzierung beim Menschen geben.

Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Vorfeld der genehmigten Forschungsarbeiten wurden umfangreiche Vorarbeiten zur Analyse der auf der Oberfläche sich kardial differenzierender befindlichen Glykoproteine durchgeführt und die zur Anwendung kommenden Methoden unter Verwendung hiPS-Zell-abgeleiteter kardialer Zellen etabliert und optimiert. Prinzipielle und technische Fragestellungen, die im Vorfeld der Analyse des Sekretoms sich kardial differenzierender Zellen zu beantworten waren, wurden ebenfalls unter Nutzung von hiPS-Zellen bearbeitet und die Ergebnisse dargelegt. Dies betrifft beispielsweise die Entwicklung eines kardialen Differenzierungsmediums, das frei von Rinderserumalbumin ist und dessen Verwendung in der kardialen Differenzierung die massenspektrometrische Analyse sezernierter Proteine ermöglicht. In einem proof-of-concept-Experiment wurde gezeigt, dass zahlreiche sekretierte Komponenten des BMP-Signalweges, der für die kardiale Differenzierung von erheblicher Bedeutung ist, in den Überständen kardial differenzierter hiPS-Zellen nachweisbar sind. Die Tatsache, dass die kardiale Differenzierung durch autokrine und parakrine Mechanismen moduliert wird, ist bekannt.

Die unter 5. benannten Gründe für die Notwendigkeit der Ver­wendung von hES-Zellen gelten unverändert fort. Gerade im Hinblick auf die Glykosylierung bestehen erhebliche Speziesunterschiede, so dass Fragen nach der Rolle spezifischer sezernierter glykosylierter Proteine bei der kardialen Differenzierung des Menschen nicht unter Nutzung von Zellen anderer Spezies geklärt werden können. Andere menschliche (Stamm)Zelltypen kommen für die im beantragten Projekt vorgesehenen vergleichenden Studien ebenfalls nicht in Frage. Adulte humane Stammzellen erfordern andere Kultivierungsbedingungen, zeigen einen von hES-Zellen verschiedenen Besatz mit Glykoproteinen und wären zudem für bestimmte Fragestellungen des Projektes, beispielsweise für die Untersuchung der Glykosylierung während früher Phasen der Differenzierung zu kardialen Zellen, aufgrund ihrer eingeschränkten Differenzierungsfähigkeit nicht geeignet. Ferner ist weiterhin nicht bekannt, ob und inwieweit hES- und hiPS-Zellen bei kardialer Differenzierung identische oder verschiedene Veränderungen im Glykoproteom durchlaufen. Dies soll erst im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten geklärt werden, so dass die Forschungsfragen unter alleiniger Verwendung von hiPS-Zellen nicht geklärt werden können.

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