48. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Frau Dr. Katrin Schrenk-Siemens (Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC), Berlin, seit April 2013 Pharmakologisches Institut der Universität Heidelberg)

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-1 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HUES7 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand des genehmigten Vorhabens ist die Entwicklung und Optimierung von Protokollen für die Gewinnung von somatosensorischen Nervenzellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen). Dazu sollen zelluläre Differenzierungsprozesse, die während der Individualentwicklung in vivo ablaufen, in vitro nachgestaltet werden. Im Projekt sollen hES-Zellen zunächst in Zellen der Neuralleiste (neural crest cells, NC-Zellen) differenziert und diese charakterisiert sowie gegebenenfalls angereichert werden. Von NC-Zellen ausgehend sollen im Anschluss Protokolle für die Gewinnung verschiedener Subtypen somatosensorischer Nervenzellen entwickelt werden. Die entstehenden Zellen werden dann mit biochemischen, molekularbiologischen, (immun)histochemischen und pharmakologischen Methoden umfassend analysiert und bezüglich ihrer Funktionalität in vitro überprüft. Im Zusammenhang mit der Differenzierung von hES-Zellen zu den verschiedenen Subtypen somatosensorischer Neuronen ist auch vorgesehen, Gene für jene Faktoren in hES-Zellen zu exprimieren, deren Produkte bei der Entwicklung und Diversifizierung dieser Zellen eine Rolle spielen. Mittelfristiges Ziel der Arbeiten ist neben einem besseren Verständnis der neuralen Differenzierung während der menschlichen Embryonalentwicklung auch die Schaffung von Grundlagen für neue, auf humanen Zellen basierende In-vitro-Zellkulturmodelle, mit deren Hilfe physiologische Prozesse bei der Schmerztransduktion untersucht, die Wirkung analgetischer Substanzen auf neuronale Zellen analysiert und gegebenenfalls neue analgetisch wirksame Substanzen identifiziert werden können. Die im Laufe des Projektes entwickelten und optimierten Methoden sollen dann auch auf humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) übertragen und die Differenzierung pluripotenter Stammzellen in sensorische Neuronen unter vergleichender Nutzung von hiPS- und hES-Zellen untersucht werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung von Kenntnissen bei der Entwicklung diagnostischer, präventiver oder therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Der Schwerpunkt des genehmigten Projektes liegt auf der Gewinnung von möglichst reinen Sub-Populationen somatosensorischer Neuronen. Bislang ist es zwar prinzipiell gelungen, periphere sensorische Neuronen aus hES-Zellen zu differenzieren. Jedoch existieren derzeit keine publizierten Protokolle für die Gewinnung bestimmter Sub-Populationen dieser Neuronen. Ferner sind die Vorgänge, die sich bei der Entwicklung und Diversifizierung sensorischer Neuronen aus den Zellen des Wurzelganglions abspielen, beim Menschen derzeit nur unvollständig verstanden.

Aus den geplanten Experimenten zur Herstellung von NC-Zellen aus hES-Zellen kann sich zunächst ein Erkenntnisgewinn über Faktoren und Signalwege ergeben, die bei der Entstehung, Segregation und Migration der Zellen der Neuralleiste eine Rolle spielen. Durch die Entwicklung und Optimierung von Protokollen zur Differenzierung der NC-Zellen zu verschiedenen Zellen des somatosensorischen Nervensystems und die umfassende Charakterisierung der Zellen ist auch ein Erkenntnisgewinn darüber zu erwarten, welche Faktoren an der Differenzierung beteiligt sind, woraus gegebenenfalls Schlüsse auf Vorgänge bei der Entstehung sensorischer Neuronen während der menschlichen Embryonalentwicklung gezogen werden können.

Wesentlicher Bestandteil der geplanten Arbeiten ist die Untersuchung der Wirkung bestimmter Transkriptionsfaktoren, die gegebenenfalls eine Rolle bei der Spezifizierung und Diversifizierung der Zellen der Neuralleiste hin zu den verschiedenen Zelltypen des somatosensorischen Nervensystems spielen. Zwar ist die Rolle bestimmter Genprodukte, beispielsweise von Runx1 und Runx3, vor allem unter Nutzung von knockout-Mausmodellen in der Vergangenheit teilweise aufgedeckt worden, jedoch sind spezifische molekulare Vorgänge der Differenzierung von sensorischen Neuronen insbesondere beim Menschen weiterhin nur wenig verstanden. Durch Überexpression der entsprechenden Gene in hES-Zellen und aus ihnen differenzierten neuralen Zellen sowie die sich anschließende umfassende Charakterisierung der jeweils entstehenden Populationen neuronaler Zellen könnten hier neue Erkenntnisse über die Funktion dieser Faktoren bei der neuronalen Differenzierung menschlicher Zellen erlangt werden.

In der weiteren Perspektive können die genehmigten Arbeiten auch dazu beitragen, Grundlagen für neue In-vitro-Zellkulturmodelle für die Schmerzforschung zu schaffen. An solchen Zellkultursystemen, die auf aus hES-Zellen gewonnenen menschlichen Schmerzrezeptoren beruhen, könnten zum einen molekulare Vorgänge erforscht werden, die sich beim Menschen auf zellulärer Ebene bei der Rezeption von Schmerz abspielen. Zum anderen könnten im Falle der Verfügbarkeit entsprechender In-vitro-Modelle auch Analgetika bezüglich ihrer molekularen Wirkungen am Menschen besser als in den bisher genutzten Zellkulturmodellen untersucht bzw. neue Analgetika identifiziert werden. Bisher verfügbare Zellkulturmodelle sind entweder tierischen Ursprungs und spiegeln die Situation im Menschen daher nur partiell wider, oder es handelt sich um immortalisierte menschliche neurale Zellen, die nur noch teilweise die Eigenschaften humaner Neuronen aufweisen. Insofern kann das Projekt im Erfolgsfall auch zu einem Erkenntnisgewinn bei der Entwicklung neuer Verfahren zur therapeutischen Anwendung beim Menschen führen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Protokolle für die Gewinnung von Zellen der Neuralleiste aus ES-Zellen der Maus, beispielsweise durch Ko-Kultivierung mit Stromazellen, sind bereits beschrieben worden. Diese Protokolle sind in der Vergangenheit bereits auf hES-Zellen übertragen und für diese teils optimiert worden. Sie führten unter weiter modifizierten Bedingungen, wie der Zugabe bestimmter Wachstums­faktoren, zur Entwicklung peripherer sensorischer Nervenzellen aus Zellen der Neuralleiste. Insofern liegen zu den formulierten experimentellen Fragestellungen und Vorgehensweisen bereits Ergebnisse über hES-Zellen vor, die im beantragten Projekt zusammengefasst und als Grundlage für eine weitere Optimierung der Protokolle für die Differenzierung von hES-Zellen in periphere sensorische Neuronen genutzt werden sollen.

Zur Vorklärung der geplanten Vorgehensweisen wurden Daten aus der Literatur vorgelegt, die zeigen, dass wesentliche Fragestellungen des Vorhabens bereits im Mausmodell oder anderen tierischen Zellen bearbeitet worden sind. Die Rolle bestimmter Transkriptions­faktoren bei der Differenzierung zu somatosensorischen Neuronen wurde in der Vergangenheit mit Hilfe entsprechender knock-out Mausmodelle untersucht. Auch die Rolle bestimmter Substanzen, deren Einfluss auf die Differenzierung sensorischer Neuronen aus hES-Zell-abgeleiteten Zellen der Neuralleiste hier untersucht werden soll, ist bereits in der Literatur dokumentiert. So ist beispielsweise bereits an ES-Zellen der Maus und des Javaneraffen gezeigt worden, dass die Entwicklung peripher sensorischer Nervenzellen aus Zellen der Neuralleiste in Gegenwart geringer Konzentrationen von BMP4 möglich ist. Die induzierende Wirkung von Wnt/beta-Catenin für eine Differenzierung von Zellen der Neuralleiste in sensorische Neuronen ist auch aus In-vivo-Experimenten bekannt.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Vorrangiges Anliegen des Forschungsvorhabens ist die Verfeinerung und Optimierung bestehender Protokolle für die Differenzierung humaner ES-Zellen, um somatosensorische Neuronen zu gewinnen. In der Perspektive soll auf dieser Grundlage ein humanes In-Vitro-Modellsystem geschaffen werden, an dem sich Prozesse der Rezeption von Schmerzen auf zellulärer Ebene besser als an bislang vorhandenen Zellsystemen untersuchen lassen. Für Untersuchungen, die in ihrer Zielstellung die Komplexität des Schmerzphänomens beim Menschen berühren, können nur humane Zellen genutzt werden. Obwohl davon auszugehen ist, dass die frühe neurale Entwicklung bei den Säugetieren nach grundlegend ähnlichen Prinzipien abläuft, bestehen spezies-spezifische Unterschiede in der Schmerztransduktion. Dies hat zur Folge, dass analgetische Substanzen in verschiedenen tierischen Zellsystemen unterschiedliche Effekte haben können. Insofern sind für die geplanten Untersuchungen menschliche Zellen erforderlich.

Zellen der Neuralleiste haben im Embryo eine starke Differenzierungstendenz und eine ausgeprägte Wanderbereitschaft. Da sie zusätzlich nur sehr früh und auch nur zeitweise während der embryonalen Entwicklung auftreten, ließen sie sich als primäre Zellen aus menschlichen Föten nur zu einem sehr frühen Zeitpunkt isolieren. Selbst bei Verfügbarkeit primärer humaner Neuralleisten-Zellen bestünde zudem das Problem der Gewinnbarkeit dieser Zellen in für die Durchführung des Forschungsprojektes ausreichenden Mengen und mit reproduzierbaren Eigenschaften. Die wenigen derzeit verfügbaren menschlichen Neuralleisten-Zell-Linien sind durch Immortalisierung mittels Onkogenen entstanden und können folglich genetische Instabilität aufweisen. Fraglich ist zudem derzeit, ob diese Zellen noch ein zu primären Zellen vergleichbares Differenzierungspotential aufweisen. Dies macht solche Zellen für die Projektdurchführung ungeeignet.

Bezüglich einer möglichen Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) wurde im Antragsverfahren dargelegt, dass derzeit nicht bekannt ist, ob sich hiPS-Zellen in somatosensorische Nervenzellen differenzieren lassen. Daher lassen sich auch keine Aussagen darüber treffen, ob sie hinsichtlich dieses spezifischen neuronalen Differenzierungspotentials hES-Zellen gleichen oder sich von ihnen unterscheiden. Die Untersuchung dieser Fragestellung ist erst Gegenstand des Forschungsvorhabens, wobei hiPS- und hES-Zellen bezüglich ihres Differenzierungsvermögens zu sensorischen Neuronen vergleichend untersucht werden sollen. Dies erfordert die Nutzung von humanen embryonalen Stammzellen auch zu Vergleichszwecken.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 20.09.2012

Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Verwendung von hES-Zellen zur Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Im Zuge der Durchführung des Forschungsvorhabens wurden bislang hES-Zellen in vitro zu Neuralleistenzellen und diese weiter in Richtung funktionaler Mechanorezeptoren differenziert. Es soll nun überprüft werden, ob die in vitro hergestellten Neuralleistenzellen auch das Potential zur Differenzierung in weitere Typen sensorischer Neutronen haben, insbesondere in thermo- und chemosensitive Neuronen. Da jedoch bislang keine In-vitro-Protokolle für derartige Differenzierungen vorliegen, soll zunächst getestet werden, ob sich die aus hES-Zellen gewonnenen menschlichen Neuralleistenzellen im Kontext einer In-vivo-Nische, dem Hühnerembryo, in die angestrebten neuralen Subtypen differenzieren. Wenn dieser proof-of-concept erbracht werden könnte, sollen dann weitere In-vitro-Untersuchungen durchgeführt werden, mit denen jene Faktoren identifiziert werden sollen, die eine Entwicklung von thermo- und chemosensitiven Neutronen aus Neuralleistenzellen bewirken.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Mittelfristiges Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist neben einem besseren Verständnis der neuralen Differenzierung während der menschlichen Embryonalentwicklung auch die Schaffung von Grundlagen für neue, auf humanen Zellen basierende In-vitro-Zellkulturmodelle, mit deren Hilfe physiologische Prozesse bei der Schmerztransduktion untersucht, die Wirkung analgetischer Substanzen auf neuronale Zellen analysiert und gegebenenfalls neue analgetisch wirksame Substanzen identifiziert werden können. Diese Zielstellungen wurden im Rahmen der Prüfung des ursprünglichen Antrags als hochrangig bewertet (siehe 4.). Die nun genehmigten Arbeiten ordnen sich dieser Zielstellung unter. Geprüft werden soll, ob die unter Verwendung des bislang genutzten Differenzierungsprotokolls aus hES-Zellen gewonnenen Neuralleistenzellen multipotent sind und außer zur (bereits gelungenen) Herstellung mechanorezeptiver Neuronen auch als Ausgangspunkt für die Gewinnung chemo- und thermosensitiver Neuronen genutzt werden können. Es ist plausibel, dass – bei Unkenntnis der für eine derartige Differenzierung in vitro erforderlichen Bedingungen – das Differenzierungspotential dieser Zellen zunächst in einer geeigneten In-vivo-Nische im Sinne eines proof-of-concept bestimmt werden soll, bevor in aufwendigen Experimenten ein Protokoll für die In-vitro-Differenzierung der genannten neuronalen Zelltypen entwickelt werden kann. Die Untersuchung des Differenzierungspotentials der aus hES-Zellen gewonnenen, ggf. multipotenten Neuralleistenzellen ist somit ein notwendiger Zwischenschritt zur Erreichung der hochrangigen Zielstellungen des bereits genehmigten Forschungsvorhabens.

Vorklärung der Forschungsfragen sowie Notwendigkeit der Verwendung von hES-Zellen für die mit dem Forschungsvorhaben verfolgten Zielstellungen.

Zur Vorklärung der Forschungsfragen wurde im Antragsverfahren u. a. dargelegt, dass die Transplantation von aus ES-Zellen der Maus abgeleiteten Vorläuferzellen in Hühnerembryonen zur Besiedlung der Spinalganglien des sich entwickelnden Hühnerembryos führte, aber auch Neuronen der Maus im (hier besonders interessierenden) peripheren Nervensystem des Embryos nachweisbar waren. Entsprechende Daten wurden bereits 2004 in der wissenschaftlichen Literatur veröffentlicht. Das gewählte In-vivo-Modell ist folglich grundsätzlich geeignet, Stimuli für die neurale Entwicklung von aus ES-Zellen hergestellten Vorläuferzellen bereitzustellen, so dass das (neurale) Differenzierungspotential der injizierten Zellen abgeschätzt und die weitere Entwicklung sich (neural) differenzierender Zellen in diesem System verfolgt werden kann.

Bezüglich der Notwendigkeit der Verwendung von hES-Zellen wird auf die unter 5. dargelegten Argumente verwiesen, die unverändert fortgelten. Im Antragsverfahren wurde überdies erneut dargelegt, dass in der wissenschaftlichen Literatur auch weiterhin kein Protokoll vorliegt, in dem die Differenzierung von hiPS-Zellen in sensorische Neuronen beschrieben wurde. Insofern ist weiterhin nicht bekannt, ob hiPS-Zellen dasselbe Potential zur Differenzierung in sensorische Neuronen aufweisen wie hES-Zellen. Folglich ist nach derzeitigem Kenntnis­stand die Verwendung von hES-Zellen voraussichtlich auch weiterhin notwendig, um die im Antrag formu­lierten Forschungsziele erreichen zu können.

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