46. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Frau Dr. Insa Schroeder (Medizinische Fakultät, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, seit April 2013 GSI Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung GmbH, Darmstadt)

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HS181 (Karolinska-Institut, Göteborg, Schweden)
• HS401 (Karolinska-Institut, Göteborg, Schweden)
• HS415 (Karolinska-Institut, Göteborg, Schweden)
• HUES2 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES6 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES8 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Im Mittelpunkt des genehmigten Forschungsprojektes steht die Entwicklung von Protokollen für die Differenzierung von humanen ES-Zellen zu endokrinen pankreatischen Zellen mit dem Ziel, Langerhans’sche Inseln in vitro herzustellen. Dabei sollen zunächst an murinen ES-Zellen entwickelte Strategien zur Gewinnung von Zellen des definitiven Entoderms (DE) auf humane ES-Zellen übertragen und die Zellen des DE angereichert werden. Diese sollen dann weiter in Zellen der pankreatischen Linie differenziert werden, wobei bereits bekannte Vorgehensweisen optimiert und der Einfluss spezifischer Faktoren (Wachstumsfaktoren, Nährstoffe etc.) auf den Differenzierungsprozess untersucht werden sollen. Die Differenzierungsprotokolle sollen anschließend auf 3D-Systeme übertragen und auf diesem Wege – u. a. in Kokultur mit Endothelzellen und anderen Zellen des menschlichen Pankreas – Insel-artige Cluster (ICCs) hergestellt werden, die die Ausreifung pankreatischer Vorläuferzellen zu funktionsfähigen Inselzellen besser ermöglichen als herkömmliche Zellkultursysteme. Die in vitro hergestellten ICCs sollen dann in diabetische Mäuse transplantiert, ihre Ausreifung und Funktionalität in vivo untersucht und der erwartete therapeutische Effekt analysiert und bewertet werden. Ferner ist vorgesehen, anhand von in vitro hergestellten ICCs Fragen der Biologie von menschlichen beta-Zellen sowie der Pathobiologie des Diabetes mellitus Typ 2, insbesondere zur Rolle des Zink-Transportproteins ZnT-8, zu untersuchen. Schließlich sollen die ICCs auch genutzt werden, um pharmakotoxikologische Untersuchungen an bekannten antidiabetischen Wirkstoffen durchzuführen und insbesondere der Frage nachzugehen, welche molekularen Mechanismen den beobachteten Nebenwirkungen zugrunde liegen, beispielsweise im Hinblick auf ein mit diesen Medikamenten in Zusammenhang stehendes erhöhtes Krebsrisiko. Die Untersuchungen sollen teils im Vergleich mit humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) durchgeführt werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung von Kenntnissen bei der Entwicklung diagnostischer, präventiver oder therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Nach dem derzeit publizierten Stand der Wissenschaft ist es bislang nicht gelungen, humane embryonale Stammzellen in vitro zu reifen pankreatischen b-Zellen zu differenzieren. Insbesondere für die Analyse von Entwicklungsprozessen, die bei der Bildung reifer pankreatischer Zellen ablaufen, zur Untersuchung der Pathogenese-Mechanismen des Diabetes mellitus und zur Entwicklung und Überprüfung von antidiabetisch wirksamen Medikamenten sind jedoch In-vitro-Systeme nötig, die die Bereitstellung funktionsfähiger pankreatischer Zellen ermöglichen und an denen die Entwicklung pankreatischer Zellen bis hin zu reifen pankreatischen Zellen nachvollzogen werden kann.

Die nun genehmigten Forschungsarbeiten sollen dazu beitragen, ein besseres Verständnis über die Mechanismen der Entwicklung pankreatischer Zellen des Menschen sowie über daran beteiligte Moleküle und Signalwege zu gewinnen. In die Untersuchungen sollen auch Faktoren einbezogen werden, deren Rolle besonders im Zusammenhang mit der Entstehung von beta-Zellen aus hES-Zellen bislang wenig verstanden ist (beispielsweise bestimmte Nährstoffe sowie eine dreidimensionale Umgebung mit Präsenz weiterer menschlicher Zelltypen des Pankreas). Im Ergebnis des Projektes könnten Protokolle zur Verfügung stehen, die eine effektivere Differenzierung von beta-Zellen im Rahmen pankreatischer Inseln als bislang ermöglichen. Zellen pankreatischer Inseln, die aus hES-Zellen gewonnen wurden, könnten langfristig Anwendung in der regenerativen Medizin finden.

Ferner können die in vitro hergestellten ICCs auch als Zellkulturmodelle sowohl für die Analyse von pathobiologischen Prozessen bei der Entstehung des Diabetes mellitus als auch für die Untersuchung von antidiabetischen Wirkstoffen dienen. Anhand in vitro hergestellter ICCs soll hier beispielsweise die Frage untersucht werden, wie der Transport des für die Biosynthese und Sekretion von Insulin notwendigen Spurenelementes Zink innerhalb der beta-Zelle reguliert ist. Dies ist von erheblicher Bedeutung, da beispielsweise Sequenzvarianten des Zink-Transport-Proteins ZnT-8 in Zusammenhang mit einer gestörten Insulinsekretion stehen können. Hierdurch ist die Gewinnung neuer Erkenntnisse über die Pathogenese des Diabetes mellitus möglich. Ferner sollen die ICCs auch genutzt werden, um bekannte antidiabetische Medikamente hinsichtlich ihrer pharmakotoxischen Eigenschaften zu untersuchen. Für solche Untersuchungen stehen bislang nur auf tierischen Zellen basierende Zellmodelle zur Verfügung, die teils nur unzureichend charakterisiert sind. Die Bereitstellung eines humanen In-vitro-Systems, mit dessen Hilfe im vorliegenden Projekt bereits die Frage des mit bestimmten Antidiabetika in Zusammenhang stehenden erhöhten Tumorrisikos untersucht werden soll, könnte in der Perspektive dazu beitragen, potentielle Nebenwirkungen antidiabetisch wirksamer Medikamente besser als bislang einschätzen zu können.

Parallel zu hES-Zellen sollen auch Untersuchungen an hiPS-Zellen stattfinden. Daten über die Fähigkeit von hiPS-Zellen, in funktionsfähige beta-Zellen zu differenzieren, liegen bislang nur in geringen Umfang vor. Im genehmigten Projekt soll nun die pankreatische Differenzierung von hES-Zellen und hiPS-Zellen vergleichend untersucht werden, was Erkenntnisse darüber erwarten lässt, inwieweit sich beide Zelltypen in ihrem Potential zur Bildung intakter pankreatischer Zellen gleichen. Die daraus resultierenden Erkenntnisse könnten ebenfalls von Bedeutung für neue In-vitro-Zellkulturmodelle sein, an denen das Verhalten von iPS-Zellen von Patienten mit Diabetes mellitus, beispielsweise in der pankreatischen Differenzierung oder unter dem Einfluss antidiabetisch wirksamer Medikamente, untersucht werden kann.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Bereits in der Vergangenheit wurden mehrere Vorgehensweisen etabliert, die die Differenzierbarkeit von ES-Zellen der Maus, aber auch des Menschen, in pankreatische Zellen nachgewiesen haben. Die Genehmigungsinhaberin selbst hat entsprechende Protokolle an ES-Zellen der Maus entwickelt und die differenzierten Zellen umfangreich bezüglich ihrer Eigenschaften in vitro und in vivo untersucht. Die an murinen ES-Zellen gewonnenen Ergebnisse sollen nun, unter Berücksichtigung bereits publizierter Resultate zur pankreatischen Differenzierung humaner ES-Zellen, auf hES-Zellen übertragen werden.

Weiterhin wurde umfassend dargelegt, dass alle wesentlichen Aspekte des Vorhabens durch entsprechende Untersuchungen an anderen Zellen als hES-Zellen bereits vorgeklärt sind. Dies betrifft beispielsweise die Untersuchung des Einflusses von bestimmten Faktoren (Glukose, Aminosäuren, Integrine) auf pankreatische Entwicklungsprozesse und auf die Proliferation von beta-Zellen, die Verwendung dreidimensionaler Systeme für die Kultivierung und Differenzierung entodermaler Zellen und Untersuchungen zur Überprüfung der Integrität und Funktionalität von aus murinen ES-Zellen differenzierten pankreatischen Zellen in vivo. Die geplante Durchführung von In-vitro-Versuchen an aus hES-Zellen hergestellten ICCs, insbesondere zur Untersuchung des Zinktransports in b-Zellen und zu karzinogenen Nebenwirkungen antidiabetisch wirksamer Pharmaka, ist – wie anhand von Literaturdaten dargelegt wurde – ebenfalls vorgeklärt.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die pankreatische Entwicklung der Maus verläuft über andere Vorläuferzellstadien als jene des Menschen. So treten während der Embryonalentwicklung der Maus beispielsweise Zellen mit Expressionsmustern für pankreatische Hormone auf, die während der menschlichen Embryonalentwicklung nicht beobachtet werden können. Es ist daher nicht davon auszugehen, dass murine ES-Zellen ein Modell darstellen, an dem sich die menschliche Pankreasentwicklung untersuchen und verstehen lässt. Zudem ist es ausdrückliches Ziel des Projektes, Zellmodelle für die Untersuchung von Pathogenese-Mechanismen des Diabetes mellitus sowie für die Untersuchung humantoxischer Wirkungen von antidiabetisch wirksamen Substanzen bereitzustellen. Für solche Modelle sind jedoch tierische Zellen weniger geeignet als humane Zellen: Der Ersatz von tierischen Zellkultursystemen, die nur sehr eingeschränkt die komplexe Natur des Diabetes mellitus widerspiegeln und die bekanntermaßen von menschlichen Zellen abweichende Reaktionen auf Pharmaka zeigen können, durch menschliche Zellen ist gerade ein wesentliches Projektziel.

Andere menschliche Zellen als hES-Zellen lassen sich zur Erreichung der Projektziele voraussichtlich ebenfalls nicht verwenden. Die genaue Natur pankreatischer Stammzellen ist nach wie vor ungeklärt. Aussagen über die genauen Bedingungen ihrer Kultivierung, ihre Vermehrungsfähigkeit in vitro sowie ein potentielles regeneratives Potential lassen sich gegenwärtig nicht oder nur eingeschränkt treffen. Für andere adulte Stammzellen des Menschen, beispielsweise aus dem Knochenmark oder aus dem Nabelschnurblut, ist bislang nicht gezeigt worden, dass sie in vitro ein mit hES-Zellen vergleichbares pankreatisches Differenzierungspotential haben. Fötale pankreatische Zellen sind bereits spezifiziert und für die Untersuchung der frühen Prozesse der pankreatischen Entwicklung des Menschen ungeeignet.

In der Literatur wird über Versuche berichtet, humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) in pankreatische Zellen zu differenzieren. Es konnte jedoch bisher nicht gezeigt werden, dass die entstehenden Zellen über alle Eigenschaften funktionsfähiger pankreatischer Zellen verfügen. Zudem soll im geplanten Vorhaben geklärt werden, in welchem Umfang sich hES-Zellen und hiPS-Zellen bezüglich ihres pankreatischen Differenzierungspotentials gleichen. Dazu sind hES-Zellen erforderlich.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 20.09.2012

Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Verwendung von hES-Zellen zur Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Die Differenzierung von hES-Zellen in pankreatische Beta-Zellen erfordert die Kokultivierung mit anderen Typen menschlicher Zellen wie endothelialen, exokrinen oder duktalen Zellen. Da primäre menschliche Zellen dieser Art nicht oder nicht in für die Durchführung des Forschungsvorhabens ausreichender Menge, reproduzierbarer Qualität sowie in der erforderlichen Spezifität zur Verfügung stehen, sollen diese Zelltypen ebenfalls aus hES-Zellen differenziert werden und die so gewonnenen Zellen für die Kokultur mit sich zu Beta-Zellen differenzierenden hES-Zellen verwendet werden. Ferner soll der Einfluss spezifischer mikro-RNAs (miRNAs) auf die Differenzierung von hES-Zellen in pankreatische Beta-Zellen untersucht werden. Dazu sollen beispielsweise Gene für bestimmte miRNAs in hES-Zellen zur Expression gebracht und der Effekt der (konditionellen) Expression dieser Gene auf die pankreatische Differenzierung von hES-Zellen untersucht werden.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Die genehmigten Forschungsarbeiten dienen dem bereits im ursprünglichen Genehmigungsverfahren als hochrangig anerkannten Ziel, effektive Protokolle für die In-vitro-Differenzierung von hES-Zellen zu reifen pankreatischen Beta-Zellen zu entwickeln (siehe 4.). Für die angestrebte Untersuchung der Pathogenese-Mechanismen des Diabetes mellitus sowie für die Entwicklung und Überprüfung von antidiabetisch wirksamen Medikamenten sind zellbasierte In-vitro-Systeme nötig. Diese erfordern die Verfügbarkeit funktionsfähiger pankreatischer Zellen. Ferner erlaubt das angestrebte  In-vitro-Differenzierungssystem, die Entwicklung pankreatischer Zellen von der Stammzelle bis hin zu reifen pankreatischen Zellen nachzuvollziehen, woraus ggf. Rückschlüsse auf die Pankreasentwicklung während der Embryogenese des Menschen gezogen werden können.

Die beantragten Arbeiten können zudem voraussichtlich weitere wichtige Erkenntnisse zu verschiedenen Fragestellungen der pankreatischen Differenzierung beim Menschen beitragen. Dies betrifft zum einen Fragen nach der Notwendigkeit von Zell-Zell-Wechselwirkungen insbesondere zwischen sich entwickelnden Beta-Zellen und Zellen des exokrinen Pankreas und des duktalen Systems für die Reifung der Beta-Zellen aus definitivem Entoderm. Ferner können im beantragten Forschungsvorhaben auch neue Erkenntnisse über die Beteiligung spezifischer miRNAs an den einzelnen Phasen der Entwicklung pankreatischer Zellen aus undifferenzierten menschlichen Zellen gewonnen werden, woraus sich ggf. Rückschlüsse auf Vorgänge bei der menschlichen Embryonalentwicklung ziehen lassen.

Vorklärung der Forschungsfragen sowie Notwendigkeit der Verwendung von hES-Zellen für die mit dem Forschungsvorhaben verfolgten Zielstellungen.

Im Antragsverfahren wurde ausführlich dargelegt, dass die effiziente Differenzierung von hES-Zellen in (reife) Beta-Zellen nach derzeitigem Kenntnisstand die Kokultur mit endothelialen, exokrinen und duktalen Zellen erfordert, da zwischen dem endokrinen Pankreas einerseits sowie dem Endothel, dem exokrinen Pankreas und dem duktalen System andererseits eine Vielzahl von Interaktionen bestehen, die für die Reifung von Beta-Zellen aus Vorläuferzellen essentiell sind. Protokolle für die Differenzierung von embryonalen Stammzellen in die genannten Zelltypen liegen in der wissenschaftlichen Literatur vor.

Ferner wurde dargelegt, dass erst während der letzten Jahren vielfältige Erkenntnisse über die mögliche Rolle spezifischer miRNAs für die Funktion pankreatischer Inseln und für die Differenzierung bzw. Reifung von Beta-Zellen aus Vorläuferzellen, aber auch für die Pathogenese des Diabetes mellitus gewonnen worden sind. Im menschlichen Pankreas treten beispielsweise verschiedene (entwicklungs- und gewebespezifisch) exprimierte miRNAs auf,  so z.B. Mitglieder der miR30-Familie, die eine Rolle bei der Ausprägung des für die Reifung von Beta-Zellen erforderlichen epithelialen Phänotyps haben. Die ebenfalls in der Pankreasentwicklung auftretende MiR375 spielt wiederum eine Rolle während der pankreatischen Organogenese in der Maus und reguliert offenbar die Masse der pankreatischen Alpha- und Betazellen. Schließlich ist bereits bekannt, dass bestimmte miRNAs auch bei der Differenzierung von hES-Zellen zu pankreatischen Zellen in hohem Maße exprimiert werden. Insofern liegen ausreichend Anhaltspunkte dafür vor, dass eine detaillierte Untersuchung des Auftretens spezifischer miRNAs während der Entwicklung pankreatischer Zellen in vitro Aufschluss über die Rolle dieser miRNAs bei der pankreatischen Differenzierung geben und geplante Modulation der Expression bestimmter miRNAs bei der Differenzierung von hES-Zellen ggf. zu verbesserten Differenzierungsprotokollen für die Gewinnung von funktionellen menschlichen Beta-Zellen führen kann.

Zur Notwendigkeit der Verwendung von hES-Zellen wurde im Antragsverfahren dargelegt, dass es nach wie vor kein Protokoll zur bona fide-Generierung von funktionalen Insulin-positiven Betazellen aus Stammzellen des Menschen gibt. Die unter 5. genannten Argumente, dass die Ver­wendung humaner embryonaler Stammzellen erforderlich ist, gelten somit unverändert fort. Einzig induzierte pluripotente Stammzellen des Menschen (hiPS-Zellen) wären eine denkbare Alternative zur Verwendung von hES-Zellen. Zwar liegen mittlerweile verschiedene Arbeiten zur pankreatischen Differenzierung von hiPS-Zellen vor. Jedoch sind die Befunde zum entsprechenden Differenzierungspotential von hiPS-Zellen teils unterschiedlich, und selbst hiPS-Zell-Linien aus demselben Labor weisen teils deutliche Schwankungen in ihrem pankreatischen Differenzierungsvermögen auf. Zudem kann derzeit nicht eingeschätzt werden, ob und inwieweit sich hES und hiPS-Zellen bezüglich ihres pankreatischen Differenzierungspotentials gleichen oder unterscheiden, da entsprechende vergleichende Studien derzeit nicht publiziert sind. Hinzu kommen weiterhin ungeklärte Fragen nach den genetischen und epigene­tischen Eigenschaften von hiPS-Zellen. Aus diesen Gründen ist nach derzeitigem Kenntnis­stand die Verwendung von hES-Zellen voraussichtlich auch weiterhin notwendig, um die im Antrag formu­lierten Forschungsziele erreichen zu können.

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