45. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Universitätsklinikum Essen

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H7 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-4 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• I3 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I4 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I6 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• KhES-1 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Kyoto, Japan)
• KhES-2 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Kyoto, Japan)
• KhES-3 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Kyoto, Japan)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Im genehmigten Projekt soll die Entwicklung humaner embryonaler Stammzellen (hES-Zellen) zu hämatopoetischen Stammzellen (hematopoietic stem cells, HSCs) untersucht werden. Das Projekt gliedert sich in zwei Teile.

In einem ersten Teilprojekt sollen Differenzierungsprotokolle für die Gewinnung reifer HSCs aus hES-Zellen in vitro etabliert und optimiert werden. Hierzu sollen u. a. Gene, die für hämatopoetische Differenzierungsfaktoren kodieren, in hES-Zellen eingebracht und der Einfluss ihrer Expression auf die hämatopoetische Differenzierung untersucht werden. Ferner soll durch Ko-Kultur von hES-Zellen mit verschiedenen stromalen Zell-Linien erprobt werden, ob auf diesem Wege eine Reifung der aus hES-Zellen gewonnenen HSCs in vitro erreicht werden kann. Durch Vergleiche der Transkriptome undifferenzierter und hämatopoetisch differenzierter Zellen sollen dann weitere Faktoren mit Relevanz für die hämatopetische Differenzierung identifiziert und diese charakterisiert werden. Die Eigenschaften und die Funktionalität der in vitro hergestellten HSCs sollen anschließend in Zellkultur und nach Transplantation in geeignete Mausmodelle detailliert untersucht werden.

Im Mittelpunkt des zweiten Teilprojektes steht die Untersuchung der Frage, ob und wieweit die Immunogenität von aus hES-Zellen hergestellten HSCs verringert werden kann. Dazu soll die Expression von Genen des humanen Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC, auch Human Leukocyte Antigenes, HLA) in hES-Zellen unterdrückt werden, was auch zu einer Verminderung der Immunogenität von aus hES-Zellen abgeleiteten HSCs führen soll. Erreicht werden soll dies durch lentiviralen Transfer von Expressionsverktoren für inhibitorische RNA (RNAi) in hES-Zellen. Hämatopoetisch differenzierte Zellen, die aus den genetisch so veränderten hES-Zellen differenziert wurden, sollen dann in vitro analysiert und anschließend in immunkompetente Mäuse transplantiert werden, um das Abstoßungsverhalten in vivo zu analysieren.

Alle Untersuchungen sollen auch im Vergleich mit aus Patienten gewonnenen humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erfolgen.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung von Kenntnissen bei der Entwicklung diagnostischer, präventiver oder therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Vorrangiges Ziel des hier beantragten Vorhabens ist die Gewinnung eines besseren Verständnisses über die hämatopoetische Differenzierung von hES-Zellen sowie der Bedingungen, unter denen die aus hES-Zellen differenzierten HSCs in vitro stabil kultiviert und propagiert werden können. Bislang konnten aus hES-Zellen in vitro noch keine reifen HSCs gewonnen werden. Insbesondere soll nun die Frage geklärt werden, ob durch die (induzierbare) Expression bestimmter Gene, insbesondere des Gens für den Transkriptionsfaktor HOXB4, günstige Effekte auf die Differenzierung von ES-Zellen zu hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und deren Expandierbarkeit erzielt werden können. Ferner soll eine geeignete Zell-Linie identifiziert werden, die die Reifung von hES-Zellen zu funktionsfähigen HSCs unterstützt. Künftig könnte durch detaillierte Untersuchungen der Wechselwirkung zwischen einer solchen geeigneten Zell-Linie und sich differenzierenden hES-Zellen weitere Erkenntnisse über die Bedingungen einer effizienten Differenzierung von hES-Zellen zu HSCs gewonnen werden.

Vergleichende Untersuchungen des Transkriptoms sich differenzierender (genetisch modifizierter und nicht modifizierter) Zellen sollen zudem Aufschluss über Induktion, Verlauf und Regulation der hämatopoetischen Differenzierung von hES-Zellen geben. Auf diesem Wege könnten insbesondere Faktoren und Signalwege mit Relevanz für die hämatopoetische Differenzierung identifiziert werden, was zu neuen Erkenntnissen über Mechanismen der Differenzierung von HSCs und – in Anlehnung daran – gegebenenfalls auch zu Erkenntnissen über die frühe Embryonalentwicklung des Menschen führen kann. Die Untersuchungen sollen ferner dazu beitragen, die genaue Identität jener in vitro darstellbaren humanen HSC-Populationen zu klären, die zur Langzeit-Repopulation des Knochenmarks in vivo nach ihrer Transplantation in geeignete Tiermodelle in der Lage sind. Im Ergebnis des Vorhabens sollen auch verbesserte Protokolle für die Bereitstellung möglichst reiner, reifer und transplantierbarer humaner HSCs zur Verfügung stehen, die gegebenenfalls zukünftig von klinischer Bedeutung sein könnten.

Gegenstand des geplanten Vorhabens ist ferner die Untersuchung der Fragestellung, ob humane ES-Zellen immunprivilegiert sind, ob sich der Immunstatus der Zellen während der hämatopoetischen Differenzierung verändert und ob sich durch gezielte Hemmung der Expression von Genen, deren Produkte für die immunologisch bedingte Abstoßung von transplantierten Zellen notwendig sind, die Immunverträglichkeit von aus hES-Zellen gewonnenen HSCs verbessern lässt. Schwerpunkt ist hier die Entwicklung von Strategien zur Verminderung der Aktivität von Molekülen mit Relevanz für die erwartete menschliche Immunantwort auf hES-Zellen und aus diesen abgeleiteten Zellen. Im Forschungsvorhaben soll somit die wesentliche Frage geklärt werden, ob durch gezielte Beeinflussung der Expression bestimmter Gene eine Verminderung der menschlichen Immunantwort auf hES-Zellen und auf die aus diesen differenzierten Zellen erreicht werden kann. Diese Fragen sind insbesondere im Hinblick auf eine mögliche klinische Verwendung von hES-Zellen, im Fall allogener Transplantationen aber auch von hiPS-Zellen oder Zellen des Nabelschnurblutes, von erheblicher Bedeutung.

Alle geplanten Untersuchungen sollen im Vergleich zwischen hES-Zellen und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erfolgen. Bislang ist die Frage, ob und inwieweit hES-Zellen und iPS-Zellen ein vergleichbares Entwicklungspotential hin zu hämatopoetischen Stammzellen haben, an menschlichen Zellen nur wenig untersucht worden. Insofern wird das Forschungsprojekt auch zu neuen Erkenntnissen über hiPS-Zellen führen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Wesentliche Aspekte des Forschungsvorhabens sind bereits unter Nutzung von murinen ES-Zellen, aber teils auch von ES-Zellen nicht-humaner Primaten untersucht worden. Die entsprechenden Arbeiten erfolgten zum Teil durch die beim Genehmigungsinhaber mit der Forschung befassten Wissenschaftler selbst.

In der Vergangenheit wurde mehrfach gezeigt, dass murine ES-Zellen zu hämatopoetischen Stammzellen differenziert werden können. Diese sind in der Lage, das Knochenmark bestrahlter Mäuse vollständig zu repopulieren. Die entsprechenden Protokolle sollen nun auf hES-Zellen übertragen werden. Der Einfluss von Faktoren wie HOXB4 auf wesentliche Signalwege, die an der hämatopoetischen Differenzierung bzw. an der Aufrechterhaltung hämatopoetisch differenzierter Stammzellpopulationen beteiligt sind, wurde im Mausmodell ebenso nachgewiesen wie die Notwendigkeit instruktiver Signale von stromalen Zellen, die gemeinsam mit sich differenzierenden ES-Zellen kultiviert wurden. Ferner liegen bereits umfangreiche veröffentlichte Daten zur Differenzierung humaner ES-Zellen zu HSCs vor.

Fragen einer möglichen Immunprivilegiertheit sowie der Veränderung der HLA-Produktion von ES-Zellen während ihrer Differenzierung wurden laut Angaben in der Literatur verschiedentlich untersucht, jedoch mit teils uneinheitlichen Resultaten. Bekannt ist, dass sich der Immunstatus von ES-Zellen, insbesondere die Expression der MHC-Gene, im Laufe ihrer Differenzierung verstärkt, was mit teils erheblichen Immunantworten auf transplantierte Derivate von ES-Zellen verbunden war. Es wurde dargelegt, dass die Expression der MHC-Gene sowohl in somatischen Zellen als auch in ES-Zellen nicht-humaner Primaten mittels RNAi erheblich vermindert werden kann. Dieser Ansatz soll nun auf hES-Zellen übertragen werden.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Im genehmigten Vorhaben sollen die Bedingungen und Erfordernisse für eine effiziente Differenzierung humaner ES-Zellen in hämatopoetische Stammzellen untersucht und molekulare Vorgänge des Differenzierungsprozesses beschrieben werden. Insbesondere sollen der Einfluss bestimmter Genprodukte analysiert und geeignete stromale Zellen identifiziert werden, die – in Ko-Kultur mit hES-Zellen – deren Differenzierung zu HSCs unterstützen. Diese Untersuchungen wurden zwar an ES-Zellen anderer Spezies, insbesondere der Maus, durchgeführt, jedoch lassen sich die Ergebnisse nicht ohne weiteres auf menschliche ES-Zellen übertragen. So können beispielsweise durch Ko-Kultur von mES-Zellen mit OP9-Zellen funktionsfähige HSCs erzeugt werden. Derselbe Ansatz war für menschliche Zellen bislang nicht erfolgreich, was darauf hinweist, dass die Bedingungen und Erfordernisse für die Differenzierung humaner Zellen zu funktionsfähigen HSCs von denen in anderen Spezies verschieden sind. Insofern kann das Forschungsziel voraussichtlich nur unter Verwendung menschlicher Zellen erreicht werden.

Zentrales Anliegen des Projektes ist die Klärung der Frage, ob und inwieweit sich die hämatopoetische Differenzierung menschlicher Zellen durch die Expression von Genen für Faktoren wie HoxB4 beeinflussen lässt. Aus dem Maus-System ist bekannt, dass HoxB4 bei der frühen hämatopoetischen Differenzierung von Zellen beteiligt ist und in viele Signalwege eingreift, die u. a. in Prozessen der frühen Determinierung und Spezifizierung pluripotenter Zellen eine Rolle spielen. Insofern können die hier geplanten Untersuchungen nur an Zellen erfolgen, in denen noch keine Determinierung bzw. Spezifizierung erfolgt ist. Dies sind nach gegenwärtigem Kenntnisstand allein embryonale Stammzellen.

Im Projekt sollen weiterhin Methoden etabliert werden, um die HLA-Expression in hES-Zellen und ihren differenzierten Derivaten zu vermindern. Es bestehen erhebliche Unterschiede in der HLA-Produktion embryonaler und somatischer Zellen. Es ist daher auch aus diesem Grunde nicht zu erwarten, dass durch Untersuchungen an anderen Zellen, beispielsweise somatischen (Stamm)Zellen, Aussagen über immunologische Eigenschaften von hES-Zellen und sich daraus differenzierenden Zellen sowie über Möglichkeiten getroffen werden können, die immunologischen Eigenschaften von hES-Zellen zu modifizieren. Vielmehr sind Untersuchungen an humanen embryonalen Stammzellen selbst erforderlich.

Auch für hiPS-Zellen ist derzeit noch nicht geklärt, ob sie ein mit hES-Zellen vergleichbares hämatopoetisches Differenzierungspotential aufweisen. Diese Frage, ob und inwieweit hES- und hiPS-Zellen hinsichtlich ihrer hämatopoetischen Differenzierbarkeit vergleichbar sind, soll im Zuge des hier beantragten Projektes erst untersucht werden, was die Nutzung von hES-Zellen voraussetzt.

nach oben