43. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Paul-Ehrlich-Institut, Langen 

2. Zell-Linie(n)

Die genehmigten Forschungsarbeiten basieren auf humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) der folgenden Linien:

• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-4 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HUES8 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• I3 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I4 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)

Im Rahmen der Erweiterung der Genehmigung vom 31.03.2015 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen der folgenden weiteren Linie genehmigt:

• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten ist die Untersuchung der Fragestellung, ob humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) die Mobilisierung bestimmter transponierbarer Elemente (long interspersed nuclear element-1, Line-1, L1) unterstützen, die bei der Mutagenese des menschlichen Genoms eine Rolle spielen können. Es soll geklärt werden, ob und in welchem Maße hES-Zellen die für die Retrotransposition  notwendigen Genprodukte der L1-Elemente produzieren und ob sich die Retrotranspositionsrate von L1-Elementen in hES-Zellen im Laufe der Differenzierung in Leber-, Lungen-, Herz-, Blut- und Nervenzellen ändert. Ferner soll untersucht werden,  ob im Laufe der Langzeitkultivierung von hES-Zellen verstärkt de-novo-Retrotranspositionsereignisse auftreten und ob die Integration von mobilisierten Retrotransposons vorzugsweise an bestimmten Stellen des Genoms von hES-Zellen stattfindet. In diesem Zusammenhang sind Untersuchungen zur genetischen Stabilität von hES-Zellen während ihrer Langzeitkultivierung geplant. Alle Untersuchungen sollen an mehreren hES-Zell-Linien und auch vergleichend zwischen humanen ES-Zellen und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) durchgeführt werden. 

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung von Kenntnissen bei der Entwicklung diagnostischer, präventiver oder therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

hES-Zellen können, insbesondere nach Langzeitkultivierung, unerwünschte genetische Veränderungen aufweisen. Dies kann auch auf die Aktivierung mobiler genetischer Elemente zurückzuführen sein, unter anderem von sog. L1-Elementen. Es ist zum einen bekannt, dass eine Aktivierung dieser Elemente bereits während der frühen Embryonalentwicklung erfolgen und mit der Entstehung genetischer Krankheiten verbunden sein kann. Zum anderen wurde bereits gezeigt, dass hES-Zellen artifizielle L1-Elemente aktivieren können, was mit einer Integration dieser Elemente in transkribierte oder potentielle offene Leserahmen im hES-Zell-Genom verbunden war.

Im genehmigten Forschungsvorhaben soll zunächst detaillierter als bislang geklärt werden, in welchem Ausmaß L1-Elemente in hES-Zellen mobilisiert werden können. Die relative Häufigkeiten von Retrotranspositionen sollen in verschiedenen hES-Zell-Linien bestimmt und Integrationsorte für mobilisierte L1-Eelmente analysiert werden. Diese Untersuchungen werden Auskunft darüber geben, ob die Retrotransposition von L1-Elenmeten in hES-Zellen ein verbreitetes Phänomen ist, das gegebenenfalls zu genetischen Veränderungen in hES-Zellen führen kann und aus diesem Grund – insbesondere im Hinblick auf eine künftige klinische Nutzung von hES-Zellen und deren differenzierten Derivaten – beachtet werden muss. Es könnten zudem weitere Erkenntnisse darüber entstehen, inwiefern Retrotransposons an der Auslösung genetisch bedingter Erkrankungen während der frühen Embryonalentwicklung des Menschen beteiligt sind.

Die Frage, ob und in welchem Maße sich die Aktivität von L1-Elementen im Laufe der Differenzierung verändert, ist derzeit ungeklärt. Im Forschungsvorhaben soll sie am Beispiel der kardialen, pulmonalen, hepatischen und hämatopoetischen Differenzierung von hES-Zellen untersucht werden. Dies ist – neben dem grundsätzlichen Interesse für die Stammzellbiologie – auch im Hinblick auf die Frage von Bedeutung, in welchem Umfang Untersuchungen zur genetischen Integrität nicht nur von hES-Zellen, sondern auch von deren differenzierten Derivaten im Vorfeld einer potentiellen Nutzung in der regenerativen Medizin erforderlich sind.

Bisherige Untersuchungen an hES-Zellen haben gezeigt, dass in ihnen genetische Veränderungen infolge von Langzeitkultivierung auftreten können, häufig unter dem Einfluss suboptimaler Kulturbedingungen. Dabei sind sowohl chromosomale Veränderungen als auch subtile Veränderungen, von denen u. U. nur einzelne Gene betroffen sind, beobachtet worden. Im Forschungsvorhaben soll nun geklärt werden, ob genetische Veränderungen während der Langzeitkultivierung von hES-Zellen auch infolge einer Aktivierung von L1-Elementen auftreten können und ob die Retrotransposition bevorzugt in bestimmte Loci des hES-Zell-Genoms erfolgt. Dies kann dazu beitragen, die Ursachen genetischer Instabilität von hES-Zellen besser zu verstehen. Auch die Beantwortung dieser Frage könnte insbesondere im Hinblick auf eine mögliche künftige therapeutische Nutzung von hES-Zellen von Relevanz sein.

Schließlich ist es Anliegen der genehmigten Forschungsarbeiten, die Aktivität von L1-Elementen zwischen hES-Zellen und hiPS-Zellen zu vergleichen. Dabei soll Aufschluss darüber gewonnen werden, ob und inwiefern sich hES-Zellen und hiPS-Zellen im Hinblick auf die Aktivität von endogenen Retrotransposons gleichen bzw. unterscheiden. Es wird erwartet, dass auch innerhalb eines Zelltyps gegebenenfalls Zell-Linien-spezifische Unterschiede in der Häufigkeit von Retrotranspositionsereignissen von L1-Elementen auftreten können, was im Hinblick auf die spezielle Eignung bestimmter Zell-Linien für die künftige Forschung oder medizinische Verwendungen relevant sein kann.

Das Projekt wird im Erfolgsfall dazu beitragen, die biologischen Eigenschaften von hES-Zellen besser zu verstehen und die Frage zu klären, ob und inwieweit L1-Retrotransposons an der genetischen Destabilisierung von hES-Zellen und hiPS-Zellen beteiligt sind. 

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen em­bryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist. 

Untersuchungen zur Expression und Mobilisierung von L1-Elementen sind bereits in einer Reihe humaner und nicht-humaner Zell-Linien durchgeführt und publiziert worden. Die Mobilisierung humaner L1-Retrotransposons wurde beispielsweise in neuronalen Vorläuferzellen und während der frühen Embryonalentwicklung der Maus nachgewiesen. Ferner liegen bereits Ergebnisse bezüglich der Aktivität von L1-Elementen in embryonalen Stammzell-Linien von (nicht-humanen) Primaten vor, die mit den im genehmigten Vorhaben zum Einsatz kommenden Methoden und Vorgehensweisen erzielt worden sind. Die technischen Voraussetzungen für die Durchführung des Projektes, insbesondere zur Untersuchung der Expression der L1-codierten Gene sowie zur Untersuchung der Retrotransposition und der Integration in das Genom der Zelle, sind etabliert und wurden bereits an anderen Zellen als hES-Zellen getestet.

Weiterhin wurde dargelegt, dass bereits Untersuchungen einer Gruppe aus den USA zur  Expression endogener L1-Elemente in humanen ES-Zellen vorliegen. In dieser Studie war auch gezeigt worden, dass hES-Zellen die Retrotransposition artifizieller L1-Elemente unterstützen, und es waren Hinweise darauf gefunden worden, dass eine Integration der Retrotransposons auch in exprimierte Gene stattfinden kann. Die im Projekt geplanten Untersuchungen, beispielsweise zur relativen Häufigkeit von Retrotranspositionsereignissen sowie zu einer möglichen Präferenz der Integration in gewisse Loci des humanen Genoms, schließen insofern an bereits vorliegende Daten zur Retrotransposition in hES-Zellen an.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Endogene L1-Retrotransposons in Maus und Mensch unterscheiden sich beispielsweise in Bezug auf Sequenz, Kopienzahl oder Retrotranspositionsraten. Zwar sind murine L1-Elemente gut charakterisiert, jedoch ist es aufgrund der oben genannten Unterschiede nicht möglich, Ergebnisse aus Untersuchungen über L1-Retrotransposons an murinen ES-Zellen auf hES-Zellen zu übertragen. Angesichts der bekannten Spezies-Unterschiede hinsichtlich der Biologie von L1-Transposons können aussagekräftige Ergebnisse über das Verhalten von L1-Retrotranposons in embryonalen Stammzellen des Menschen nur unter Nutzung menschlicher Zellen, nicht aber unter Verwendung von ES-Zellen anderer Spezies, gewonnen werden.

Ferner bestehen derzeit keine Anhaltspunkte dafür, dass aus Untersuchungen über die Biologie von L1-Elementen an menschlichen adulten Stammzellen Rückschlüsse darauf gezogen werden könnten, wie sich L1-Elemente in hES-Zellen verhalten. So ist beispielsweise bekannt, dass neuronale Stammzellen die L1-Retrotransposition unterstützen, was in hämatopoetischen Stammzellen nicht nachgewiesen werden konnte. Ferner soll im Projekt auch die Frage nach einer möglichen Veränderung der L1-Retrotransposition bei Differenzierung in Zelltypen verschiedener Keimblätter untersucht werden. Eine solche Untersuchung ist mit adulten Stammzellen, die nach gegenwärtigem Kenntnisstand in ihrer Differenzierungsfähigkeit bereits eingeschränkt sind und sich nicht mehr in Zelltypen aller drei Keimblätter entwickeln können, nicht möglich.  Auch mögliche Veränderungen in der Retrotranspositionsaktivität (und damit verbundene Konsequenzen für die genetische Stabilität) infolge der Langzeitkultur von hES-Zellen können nur an hES-Zellen selbst untersucht werden. hES-Zellen erfordern hochspezifische Kulturbedingungen, und es ist bekannt, dass deren Modifikation mit genetischen Veränderungen in der Langzeitkultur verbunden sein kann. Die Frage danach, ob die Bedingungen der Langzeitkultur auch die Retrotranspositionsrate verändern kann, kann daher nur an hES-Zellen selbst geklärt werden.

Zur Frage der Biologie von L1-Elementen in hiPS-Zellen liegen derzeit keine publizierten Daten vor. Es ist demnach nicht bekannt, ob und inwieweit sich hES-Zellen und hiPS-Zellen in diesem Punkt gleichen bzw. unterscheiden. Es ist zudem gerade ein Anliegen des Forschungsprojektes, die Frage zu klären, ob solche Unterschiede zwischen beiden Typen menschlicher Zellen bestehen, so dass hiPS-Zellen hier nicht anstelle von hES-Zellen verwendet werden können.

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