39. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Zentrum für Integrative Psychiatrie gGmbH, Kiel

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten basieren auf humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) der folgenden Linien:

• H7 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• hESBGN-01 (BresaGen, Inc., Athen, GA, USA)
• hESBGN-02 (BresaGen, Inc., Athen, GA, USA)
• hESBGN-03 (BresaGen, Inc., Athen, GA, USA)

Im Rahmen der Erweiterung der Genehmigung vom 07.03.2017 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen der folgenden weiteren Linien genehmigt:

• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H13 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H14 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) ist die Untersuchung der Fragestellung, welche spezifische Ausprägung ein für pluripotente Zellen charakteristischer allgemeiner Phänotyp in diesen Zellen sowie in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) hat. Es soll ferner bestimmt werden, welche Variabilität ein solcher für pluripotente Zellen typischer Phänotyp innerhalb des gleichen pluripotenten Zelltyps (also z.B. zwischen verschiedenen hES-Zell-Linien) und zwischen verschiedenen pluripotenten Zelltypen (hier: zwischen hES- und hiPS-Zellen) aufweisen kann. Dazu sollen mehrere hES-Zell-Linien und hiPS-Zell-Linien bezüglich ihres mRNA-Transkriptoms, ihres miRNA-Transkriptoms, ihres Genoms sowie ihres Epigenoms unter Nutzung von Microarrays vergleichend untersucht werden.

Die dabei gewonnenen Daten sollen dann auf Gemeinsamkeiten und Unterschiede von iPS- und hES-Zellen hin analysiert werden. Dabei sollen sowohl Vergleiche zwischen den beiden Typen von Stammzellen (hES- vs. hiPS-Zellen), innerhalb verschiedener Linien desselben pluripotenten Zelltyps, innerhalb derselben Stammzell-Linie (z.B. nach längerer In-vitro-Kultivierung) und zwischen verschiedenen hiPS-Zellen aus derselben Zellquelle (z.B. hiPS-Zellen desselben Patienten, die unabhängig voneinander hergestellt worden sind) vorgenommen werden. Ferner sollen die entsprechenden Parameter auch nach Differenzierung der pluripotenten Zellen in Fibroblasten, Blutzellen und neurale Zellen erhoben und jeweils vergleichend bewertet werden.

In diesem Zusammenhang sollen auch SNPs (single nucleotide polymorphisms) für hES-Zellen definiert werden, die der Identitätsbestimmung der jeweiligen hES-Zellen dienen können. Es sollen dann mögliche genomische Veränderungen bestimmt werden, die sich im Laufe der Kultivierung ergeben und die gegebenenfalls zu Veränderungen in den für die Pluripotenz der untersuchten Zellen wesentlichen Eigenschaften führen. Auch mögliche epigenetische Veränderungen sowie Veränderungen im Transkriptom der Zellen infolge von Langzeitkultivierung und mögliche Konsequenzen für die Eigenschaften der Zellen sollen bestimmt werden. Ferner sollen hiPS- und hES-Zellen sowie deren differenzierte Derivate in Bezug auf typische gesamtgenomische Methylierungsmuster klassifiziert werden.

Auf Grundlage der erhobenen Daten sollen dann mögliche Wechselwirkungen zwischen Proteinen vorhergesagt und anschließend experimentell bestätigt werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung von Kenntnissen bei der Entwicklung diagnostischer, präventiver oder therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Bislang ist für hiPS-Zellen nur unzureichend bekannt, welche allgemeinen (pluripotenzbestimmenden) Eigenschaften sie haben bzw. hinsichtlich welcher Parameter sie sich untereinander bzw. von pluripotenten hES-Zellen unterscheiden. Unmittelbares Ziel des beantragten Projektes ist es daher, auf der Basis einer umfangreichen Erhebung experimenteller Daten über menschliche pluripotente Zellen und ihre differenzierten Derivate solche Parameter zu identifizieren bzw. zu verifizieren, die zuverlässige Aussagen über die Pluripotenz dieser Zellen, insbesondere von hiPS-Zellen, ermöglichen. Durch vergleichende Analyse der im Projekt erhobenen Datensätze sollen dann die Charakteristika eines „allgemeinen“ pluripotenten Phänotyps definiert bzw. präziser als bislang beschrieben werden. Dieser allgemeine, von der jeweilig konkret genutzten Zellquelle unabgängig definierbare Phänotyp soll dann als Grundlage für die Entwicklung eines Algorithmus dienen, der zur Bewertung verschiedener Zellen, insbesondere neuer hiPS-Zell-Linien, in Hinblick auf deren vermutete Pluripotenz genutzt werden kann.

Die Definition und umfassende Beschreibung eines für alle pluripotenten Zellen des Menschen charakteristischen Phänotyps ist von erheblicher Bedeutung, da gegenwärtig nur unzureichend bekannt ist, ob und inwiefern hES-Zellen und hiPS-Zellen in ihrer Gesamtheit auf den genannten molekularen Ebenen zelltypspezifische Unterschiede aufweisen und ob diese möglicherweise wiederum zu Unterschieden auch in für die Pluripotenz der Zellen weiteren wesentlichen Eigenschaften führen. Eine Bewertung der Eigenschaften von hiPS-Zellen auf der Grundlage eines auf einer breiten experimentellen Basis beruhenden Algorithmus könnte die Bestimmung der Eigenschaften neuer, gegebenenfalls patientenspezifischer, hiPS-Zellen deutlich vereinfachen und zuverlässigere Ergebnisse liefern als bisher. Dies ist angesichts der sich ständig verändernden Methodik zur Herstellung von hiPS-Zellen sowie der Heterogenität des zur Herstellung dieser Zellen benutzten Materials von erheblicher Bedeutung, da für die jeweils hergestellten hiPS-Zellen die Frage nach deren Pluripotenz im Einzelfall zu beantworten ist. Zuverlässige und reproduzierbare Algorithmen zur Prüfung der Pluripotenz, die zudem auf einer breiten experimentellen Basis fußen, könnten dies erheblich erleichtern und so einen wesentlichen Beitrag zur Forschung an hiPS-Zellen leisten.

Gleichzeitig lassen die geplanten Untersuchungen neue wesentliche Erkenntnisse über die Variabilität erwarten, die innerhalb eines allgemeinen, für menschliche pluripotente Zellen typischen Phänotyps auftreten kann. Die Grenzen dieser Variabilität des pluripotenten Phänotyps sollen hier näher bestimmt und die Frage geklärt werden, und ob es dabei charakteristische Unterschiede zwischen hES- und hiPS-Zellen gibt. In diesem Zusammenhang soll auch untersucht werden, ob und inwieweit die Langzeitkultivierung von verschiedenen pluripotenten Zellen (hES-Zellen und hiPS-Zellen) zu Veränderungen in deren Genom, Epigenom und Transkriptom führen kann. Veränderungen dieser Art sind für beide Zelltypen teilweise erst im Ansatz untersucht. Ferner ist bislang nur teilweise bekannt, welche konkreten Ursachen diesen Veränderungen zugrunde liegen und welche Konsequenzen bereits bekannte Veränderungen in pluripotenten Zellen als Folge einer Langzeitkultivierung (beispielsweise die Methylierung bestimmter Promotoren) auf andere für die Pluripotenz wesentliche Eigenschaften dieser Zellen haben. Diese Zusammenhänge sollen im genehmigten Projekt untersucht und modelliert werden, was unter anderem auch im Hinblick darauf bedeutsam ist, dass bislang bekannte genetische und epigenetische Veränderungen, die bei der Kultivierung von pluripotenten Zellen auftreten, teilweise auch mit malignem Wachstum von Zellen assoziiert sein können. Dieser Umstand kann insofern künftig auch klinisch relevant sein, als die Kultivierung pluripotenter Zellen über einen längeren Zeitraum Voraussetzung ist, um sie in der regenerativen Medizin nutzen zu können.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Die Tatsache, dass die Definition eines allgemeinen pluripotenten Phänotyps für menschliche pluripotente Zellen auf Grundlage molekularer Daten prinzipiell möglich ist, ist aus jüngsten Publikationen bekannt. Die bislang durchgeführten Untersuchungen basierten jedoch ausschließlich auf mRNA-Profilen und deren bioinformatischer Analyse, die im genehmigten Vorhaben nun fortgeführt und auf andere molekulare Eigenschaften der untersuchten Zellen ausgedehnt werden sollen, um das bereits in Ansätzen entwickelte Klassifikationssystem für menschliche pluripotente Zellen weiterentwickeln und präzisieren zu können. Es wurde ferner dargelegt, dass Vorversuche unter Nutzung pluripotenter Zellen anderer Spezies, beispielsweise muriner embryonaler Stammzellen, nicht zur weiteren Vorklärung der hier interessierenden wissenschaftlichen Fragestellung führen können. Dies ist vor allem dadurch begründet, dass die molekularen Grundlagen von Pluripotenz zwischen Zellen unterschiedlicher Spezies verschieden sind. So tragen beispielsweise in murinen ES-Zellen teils andere Signalübertragungswege zur Aufrechterhaltung der zellulären Pluripotenz bei als bei entsprechenden menschlichen Zellen. Zudem bestehen hinsichtlich der genetischen und epigenetischen Eigenschaften bei Langzeitkultivierung teils ebenfalls deutliche Unterschiede zwischen murinen und humanen ES-Zellen.

Es wurde ferner dargelegt, dass die zur Anwendung kommenden Methoden, beispielsweise die Vorgehensweisen bei der Mikrochip-basierten Untersuchung des Transkriptoms bzw. Epigenoms, der geplanten genetischen Modifikationen von hES-Zellen oder deren Differenzierung an murinen bzw. humanen Zellen durchgeführt und in der Literatur beschrieben worden sind.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Ziel des Vorhabens ist die Etablierung eines Algorithmus zur Bewertung der Pluripotenz menschlicher Zellen, hier insbesondere bei der Herstellung von induzierten pluripotenten patientenspezifischen Zellen von Menschen mit neuropsychiatrischen Erkrankungen. Die Bewertung der Pluripotenz von menschlichen induzierten Stammzellen muss sich aber immer auf das humane System, insbesondere auf hES-Zellen, beziehen; ein Vergleich mit Daten von pluripotenten Stammzellen anderer Spezies ist – aufgrund zahlreicher spezies-spezifischer Besonderheiten in den molekularen Grundlagen der zellulären Pluripotenz – nicht möglich. Folglich kann auch ein Algorithmus, der für die Einschätzung von Pluripotenz menschlicher Zellen genutzt werden soll, nur auf Grundlage von Daten entwickelt und präzisiert werden, die aus Untersuchungen an menschlichen Zellen stammen.

Der zu entwickelnde Algorithmus soll zur Bewertung von für Pluripotenz wesentlichen zellulären Eigenschaften dienen. Dies setzt voraus, dass er auf Grundlage von Datensätzen entwickelt wird, die aus pluripotenten Zellen stammen. Bisherige Untersuchungen zu dieser Fragestellung haben gezeigt, dass adulte Stammzellen, aber auch humane embryonale Karzinomzellen (EC-Zellen), gerade nicht den für pluripotente Stammzellen typischen molekularen Phänotyp aufwiesen, also für die vergleichende Abschätzung von Pluripotenz ungeeignet sind. Erforderlich ist vielmehr ein Vergleich mit gut charakterisierten hES-Zellen.

Eine ausschließliche Nutzung humaner iPS-Zellen ist zur Erreichung der Forschungsziele ebenfalls nicht möglich: Im Forschungsvorhaben soll für die zu untersuchende Fragestellung erst geklärt werden, ob, in welchem Umfang und mit welcher Reproduzierbarkeit hiPS-Zellen einen für pluripotente Zellen typischen molekularen Phänotyp aufweisen.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 28.06.2011

Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Ausgehend von der Erkenntnis, dass Pluripotenz ein relativ stabiler Phänotyp einer Zelle ist, der jedoch in verschiedenen ineinander übergehenden Zuständen zu existieren scheint, sollen im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten diese Zustände näher bestimmt sowie ihre jeweilige Bedeutung für die Aufrechterhaltung von Pluripotenz bzw. für den Übergang von einem pluripotenten in einen differenzierten Phänotyp analysiert werden.

Dazu sollen die verschiedenen Zustände von Pluripotenz in menschlichen pluripotenten Stammzellen zunächst näher charakterisiert werden, Karten („maps“) des Transkriptoms, Epigenoms und Proteoms ausgewählter hES- und hiPS-Zell-Linien erstellt sowie die ein Modell zur Vorhersage jener zellulären Zustände etabliert und verifiziert werden, in denen natürlicherweise ein irreversibler Weg von der Pluripotenz in Richtung der Differenzierung eingeschlagen wird.

Insbesondere sollen Gene für Reprogrammierungsfaktoren in sich differenzierenden hES-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung aktiviert werden, um Fragen der Umkehrbarkeit oder Endgültigkeit der Differenzierung zu bestimmten Zeitpunkten zu klären. Mittels proximity ligation assay soll die Bindung von Transkriptionsfaktoren an bestimmte DNA-Regionen während der Differenzierung analysiert und der Ablauf der Differenzierung durch Hochdurchsatzmikroskopie sowie Videomikroskopie dokumentiert werden. Epigenetische Eigenschaften verschiedener pluripotenter und sich differenzierender Zellen sollen detaillierter als bislang vorgesehen unter Einsatz veränderter Methoden, beispielsweise durch Identifizierung DNase-I-hypersensitiver Regionen im Gesamtgenom (genomic DNAse I hypersensitivity site mapping) analysiert werden.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Für die Hochrangigkeit der Ziele der beantragten Arbeiten gelten zum einen die im ursprünglichen Antrag von 2009 dargelegten Argumente in gleicher Weise. Die Definition und umfassende Beschreibung eines für alle pluripotenten Zellen charakteristischen Phänotyps sowie die Charakterisierung verschiedener Spielarten dieses Phänotyps ist weiterhin von erheblicher Bedeutung, da gegenwärtig nur unzureichend bekannt ist, ob und inwiefern die offensichtlich auftretenden verschiedenen Zustände von Pluripotenz von biologischer Relevanz sind. Das ebenfalls im ursprünglichen Antrag formulierte Forschungsziel, einen Algorithmus zur Einschätzung der Frage zu entwickeln, ob ein gegebener Zelltyp pluripotent ist oder nicht, wird hier weiterverfolgt; allerdings werden die ursprünglich geplanten Arbeiten über die Analyse des Transkriptoms und von Protein-Protein-Wechselwirkungen hinaus ausgedehnt und sollen in verstärktem Maße Analysen des Epigenoms sowie Untersuchungen des micro-RNA-Profils beinhalten. Die Entwicklung eines solchen Algorithmus ist weiterhin von erheblicher Relevanz, um – unabhängig von herkömmlichen Methoden der Pluripotenztestung – einen zuverlässigeren Indikator als bislang zum Nachweis der Pluripotenz menschlicher Zellen verfügbar zu machen.

Zum anderen zielen die geplanten Arbeiten nun auch auf die Definition spezifischer Zustände von Pluripotenz sowie auf die Bestimmung eines zellulären Zustandes, in dem eine irreversible Determinierung der Zelle für die Differenzierung erfolgt ist, aus dem also eine Rückkehr der Zelle in einen anderen pluripotenten Zustand nicht mehr möglich ist. Diesem Zweck dienen auch jene Experimente, in denen die Erforderlichkeit spezifischer Faktoren für die Reprogrammierung zu pluripotenten Zellen in bestimmten Entwicklungsstadien dienen sollen. Diese Untersuchungen, die hier beispielhaft an der neuralen Differenzierung durchgeführt werden sollen, können zu einem vertieften Verständnis von Molekülen, Signalwegen und Wechselwirkungen führen, die der Auslösung früher neuraler Differenzierungsprozesse zugrunde liegen. Im Ergebnis der Untersuchungen könnten die Rolle spezifischer Transkriptionsfaktoren während der (frühen) neuralen Differenzierung aufgeklärt, Modelle zur Vorhersage der neuralen Differenzierungsfähigkeit von Zellpopulationen etabliert und dadurch die Grundlage für die Entwicklung neuer Differenzierungsprotokolle geschaffen werden.

Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Bezüglich der Vorklärung der beantragten Arbeiten wurde im Antragsverfahren auf die Darlegungen im Antrag verwiesen, der mit Bescheid vom 02.04.2009 genehmigt wurde (siehe 5.). Ergänzend wurden insbesondere eigene Untersuchungen zur Entwicklung von Algorithmen zur Einschätzung von Pluripotenz dargelegt, die u. a. auf Untersuchungen  von hES- und hiPS-Zellen im Rahmen der zuvor genehmigten Forschungsarbeiten basieren. Diese betreffen beispielsweise Modelle für Protein-Protein-Wechselwirkungen, die die Voraussage bestimmter für Pluripotenz wesentlicher Eigenschaften von embryonalen Stammzellen zulassen.

Hinsichtlich der Notwendigkeit der Verwendung von hES-Zellen für die Durchführung der beantragten Forschungsarbeiten gelten die unter 5.) dargelegten Gründe weiterhin. Gegenstand der genehmigten Arbeiten ist die Identifizierung bzw. Untersuchung von Molekülen und Signalwegen, die an der Aufrechterhaltung von Pluripotenz, am Wechsel zwischen verschiedenen pluripotenten Zuständen sowie an der Auslösung früher Differenzierungsereignisse in pluripotenten Stammzellen des Menschen beteiligt sind. Diese Untersuchungen lassen sich aufgrund der stark unterschiedlichen Regulation von Pluripotenz in Stammzellen verschiedener Spezies nur mit pluripotenten Stammzellen des Menschen durchführen. Da die Untersuchungen vergleichend zwischen hES- und hiPS-Zellen durchgeführt werden sollen, ist die Verwendung von hES-Zellen auch weiterhin erforderlich.

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