30. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Frau Dr. rer. nat. Kaomei Guan, Georg-August-Universität Göttingen

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten basieren auf humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) der folgenden Linien:

• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H7 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-2 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-4 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• I3 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I4 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I6 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Die Einfuhr und Verwendung der o. g. humanen embryonalen Stammzell-Linien wurden für ein Vorhaben genehmigt, in dem zum einen pluripotente Stammzellen aus menschlichem Hodengewebe vergleichend zu hES-Zellen untersucht, zum anderen multipotente kardiale Vorläuferzellen aus hES-Zellen hergestellt und charakterisiert werden sollen.

Ausgangspunkt für den ersten Projektteil ist die Tatsache, dass multipotente adulte Keimbahn-Stammzellen (maGSCs), die bestimmte Eigenschaften pluripotenter Zellen aufweisen, aus Zellen des Maushodens gewonnen und als stabile Kultur etabliert wurden. Entsprechende Versuche, diesen Typ adulter Stammzellen auch aus menschlichem Hodengewebe als Zellinie zu etablieren, waren bislang nicht erfolgreich. Daher soll im genehmigten Projekt die Expression bestimmter Gene, die in hES-Zellen mit Pluripotenz assoziiert ist, vergleichend zwischen hES-Zellen und spermatogonialen Stammzellen (SSCs) des Menschen untersucht werden. Durch Vergleich der Expressionsdaten sollen Gene identifiziert werden, deren Expression nach ihrem Transfer in SSCs in diesen gegebenenfalls Pluripotenz induzieren können. Ferner soll überprüft werden, ob die Verwendung von durch hES-Zellen konditioniertem Medium für die Kultivierung menschlicher SSCs bzw. die gemeinsame Kultivierung von SSCs mit hES-Zellen dazu beitragen kann, Pluripotenz in humanen SSCs zu induzieren.

In einem zweiten, unabhängigen Projektteil soll untersucht werden, nach welchen Verfahren sich hES-Zellen zu multipotenten Vorläuferzellen des Herzens differenzieren lassen, die eine Differenzierung in verschiedene kardiovaskuläre Zelltypen erlauben. Die Protokolle zur Gewinnung dieser Zellen, die u. a. anhand eines von ihnen produzierten Rezeptors für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2) identifiziert werden können, sollen optimiert und die VEGFR-2-positiven Zellen bezüglich ihrer Fähigkeit untersucht werden, in Herzmuskelzellen, glatte Muskelzellen und Endothelzellen zu differenzieren.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungs­zielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grund­lagen­forschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Zellen aus dem Hoden der Maus konnten in Kultur genommen und als Zell-Linien kultiviert werden, die bestimmte Eigenschaften pluripotenter Stammzellen zeigten. Diese murinen „multipotenten adulten Keimbahn-Stammzellen“ (multipotent adult germline stem cells, maGSCs) lassen sich in vitro in verschiedene Zelltypen differenzieren, darunter therapeutisch potentiell relevante kardiale und neurale Zellen. Versuche, entsprechende Zellinien aus menschlichem Hodengewebe zu etablieren, waren bislang nicht erfolgreich. Die im Projekt geplanten Arbeiten sind darauf gerichtet, unter Nutzung und in Vergleich mit hES-Zellen Faktoren und Bedingungen zu identifizieren, die bei der Etablierung humaner maGSCs aus Stammzellen des Hodens hilfreich sein können. Im Lauf der Untersuchungen könnten Erkenntnisse darüber gewonnen werden, welche Moleküle und Signalwege an der Aufrechterhaltung bzw. Induktion von Pluripotenz in humanen SSCs beteiligt sind. Zusätzlich zu diesem Erkenntnisgewinn für die Grundlagenforschung könnten die hier geplanten Untersuchungen einen Beitrag dazu leisten, künftig aus humanem Hoden pluripotente Zell-Linien zu etablieren, die als Ausgangsmaterial für die Herstellung eines therapeutisch nutzbaren, patientenspezifischen Zellmaterials für die Gewebeersatz-Therapie dienen sollen.

Im zweiten Projektteil ist die Untersuchung der Fragestellung vorgesehen, ob hES-Zellen in vitro zu multipotenten Vorläuferzellen differenzieren können, die den Marker VEGFR-2 tragen und die sich in Zelltypen des Herzens fortentwickeln können. VEGFR-2-positive Zellen stellen das humane Pendant zu multipotenten murinen Vorläuferzellen dar, die u. a. durch das Vorhandensein der fötalen Leberkinase 1 (fetal liver kinase 1, Flk-1) charakterisiert sind. Sie sind jedoch im Gegensatz zu diesen wenig untersucht. Das Projekt kann vor allem zur Klärung der Frage beitragen, ob aus hES-Zellen differenzierte VEGFR-2-positive Vorläuferzellen ähnliche Eigenschaften wie die entsprechenden Mauszellen aufweisen, insbesondere ein vergleichbar großes Differenzierungspotential. Die Ergebnisse dieses Projektteils können voraussichtlich dazu beitragen, das Verständnis für grundlegende Prozesse und Methoden der Differenzierung von hES-Zellen in multipotente Vorläuferzellen mit einem breiten Differenzierungspotential zu vertiefen und auf dieser Grundlage verbesserte Protokolle für die kardiale Differenzierung von hES-Zellen zu entwickeln.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und der Übergang zur Nutzung humaner ES-Zellen folglich gerechtfertigt ist.

Die Genehmigungsinhaberin selbst hat eine Methode zur Etablierung von maGSCs aus Hoden der Maus entwickelt sowie die Differenzierung dieser Zellen in kardiale und andere Zellen durchgeführt und dies publiziert. Die Arbeiten beschreiben auch vergleichende Untersuchungen zum Vorliegen von mit Pluripotenz assoziierten Faktoren in murinen ES-Zellen (mES-Zellen) und Stammzellen aus dem Hoden der Maus. Die Gene, deren Expression vergleichend in hES-Zellen und SSCs untersucht werden soll, wurden in publizierten Analysen der Internationalen Stammzellinitiative (ISCI) als für die Pluripotenz von hES-Zellen wesentlich bestimmt. Die Induktion von einzelnen Eigenschaften pluripotenter Zellen durch Kultivierung von bereits differenzierten Zellen mit einem durch mES-Zellen konditionierten Medium wurde in der Literatur ebenfalls beschrieben. Im Antragsverfahren wurde auch dargelegt, dass pluripotente Zellen aus Maushoden gewonnen und als Zell-Linien etabliert und kultiviert werden konnten, ohne dass dazu eine Kokultivierung mit ES-Zellen der Maus bzw. eine Kultivierung mit durch mES-Zellen konditioniertem Medium erforderlich gewesen wäre. Offenbar bestehen Unterschiede in den Stammzellen aus dem Hoden von Maus und Mensch bezüglich der Gewinnbarkeit von maGSCs. Die Etablierung und Kultivierung von murinen maGSCs kann unabhängig von aus mES-Zellen sezernierten Faktoren und von Kokultivierung mit mES-Zellen erfolgen; insofern würde die Untersuchung der hier betrachteten Fragestellung in Mauszellen voraussichtlich nicht zu einem für die Vorklärung des Projektes relevanten Erkenntnisgewinn führen.

Im Antragsverfahren wurde weiterhin dargelegt, dass die Induktion der Differenzierung von mES-Zellen zu Flk1-positiven Zellen in der Literatur ebenso beschrieben wurde wie die Nutzung der geplanten Kultivierungs- und Differenzierungsmethoden, um den Anteil Flk-1-postiver Zellen bei der Differenzierung zu erhöhen. Die Protokolle, die für die Differenzierung VEGFR-2-positiver Zellen zu den verschiedenen kardialen Zelltypen genutzt werden sollen, sind in der Arbeitsgruppe der Genehmigungsinhaberin für die Differenzierung von maGSCs der Maus entwickelt und publiziert worden. Die Verwendung dieser Protokolle führte, wie ebenfalls dargelegt wurde, zur kardialen und vaskulären Differenzierung Flk1-positiver Zellen.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Um Pluripotenz durch Expression ausgewählter Gene in humanen SSCs induzieren zu können, ist es notwendig, zu überprüfen, ob und inwieweit aus humanem Hodengewebe etablierte SSCs Eigenschaften menschlicher pluripotenter Zellen haben und bezüglich welcher mit Pluripotenz assoziierter Faktoren gegebenenfalls Unterschiede zu hES-Zellen bestehen. Dies kann nur durch direkten experimentellen Vergleich beider Zelltypen ermittelt werden. Auch die Klärung der Frage, ob und inwieweit sich humane SSCs bei der Kultivierung unter Kokultur mit hES-Zellen oder unter Nutzung von durch hES-Zellen konditioniertem Medium in einen pluripotenten Zustand versetzen lassen, erfordert die Verwendung von hES-Zellen. hES-Zellen benötigen zum einen hochspezifische Kulturbedingungen, zum anderen sezernieren sie Faktoren, die für ihre Selbsterhaltung notwendig sind und wachsen i. a. nur in engem Zell-Zell-Kontakt. Es ist derzeit nicht bekannt, ob ein anderer Zelltyp die gleichen spezifischen Faktoren für die Aufrechterhaltung von Pluripotenz wie hES-Zellen bereitstellen kann.

Auch die Untersuchung der Fragestellung, ob und auf welchem Wege sich humane ES-Zellen in vitro zu einem frühen, multipotenten Vorläuferzelltyp (VEGFR-2-positive Vorläuferzellen) differenzieren lassen und inwiefern humane VEGFR-2-positive Vorläuferzellen des Menschen sich – analog zu murinen Flk-1-positiven Vorläuferzellen – in verschiedene Zelltypen des Herzens zu entwickeln vermögen, erfordert die Verwendung humaner ES-Zellen. Bei VEGFR-2-positiven Zellen handelt es sich um einen sehr frühen humanen Vorläuferzelltyp mit relativ breitem Differenzierungspotential. Dieser Zelltyp kann in vitro nur aus einem noch früheren Zelltyp des Menschen hergestellt werden. Dies sind nach gegenwärtigem Kenntnisstand nur hES-Zellen. Die weiteren geplanten Untersuchungen, die der Klärung des Differenzierungspotentials humaner VEGFR-2-positiver Zellen dienen, könnten theoretisch auch ohne erneuten Rückgriff auf hES-Zellen erfolgen, wenn humane VEGFR-2-positive Zellen aus primären Quellen zur Verfügung stünden. Dies ist derzeit jedoch nicht der Fall. Diese Vorläuferzellen sind in vivo in nur sehr geringer Zahl vorhanden und können derzeit, wie im Antragsverfahren dargelegt wurde, nicht in Kultur vermehrt werden.

Auch ist derzeit nicht bekannt, ob humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) des Menschen zur Erreichung der formulierten Forschungsziele geeignet sind. Es ist derzeit nicht geklärt, ob die molekularen Grundlagen für die Pluripotenz dieser Zellen mit denen von hES-Zellen identisch sind. Die Fähigkeit dieser Zellen, Pluripotenz in anderen Zelltypen (beispielsweise infolge von Zellfusion) zu induzieren, ist bislang wenig untersucht. Im Gegensatz zu ES-Zellen der Maus wurde für iPS-Zellen dieser Spezies bislang keine Differenzierungsfähigkeit in Flk-1-positive Vorläuferzellen gezeigt. Dies wäre aber erforderlich, um ein Differenzierungspotential in VEGFR-2-positive Vorläuferzellen erwarten zu können, wie es für hES-Zellen angenommen werden kann. Darüber hinaus liegen keine Studien zur gerichteten kardialen und vaskulären Differenzierung von iPS-Zellen vor. Folglich bleibt auch im Hinblick auf den derzeitigen Kenntnisstand über iPS-Zellen die Verwendung von hES-Zellen zur Erreichung der Projektziele erforderlich.

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