24. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Prof. Dr. Marcel Leist (Universität Konstanz)

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten basieren auf humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) der folgenden Linien:

• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-2 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Für ein Forschungsvorhaben zur Thematik „Entwicklung und Charakterisierung von Modellsystemen für die neurotoxikologische Sicherheitsprüfung von Arzneimitteln und Chemikalien mit In-vitro-Methoden“ wurde die Verwendung der oben genannten humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) genehmigt.

Im Rahmen des genehmigten Vorhabens sollen hES-Zellen in vitro und unter Nutzung unterschiedlicher Differenzierungsprotokolle in verschiedene Typen humaner neuraler Zellen (Neuronen und Astrozyten) differenziert werden. Im Prozess der Differenzierung sollen nach Möglichkeit stabile neurale Stamm- und Vorläuferzell-Kulturen etabliert und deren molekulare Eigenschaften im Vergleich mit hES-Zellen analysiert werden. Insbesondere sollen aufgrund vergleichender Transkriptom-Untersuchungen Moleküle und Signalwege identifiziert werden, die bei der neuralen Differenzierung eine Rolle spielen. Auf dieser Grundlage sollen verbesserte Methoden für die neurale Differenzierung humaner ES-Zellen entwickelt werden.

Im weiteren Verlauf des Projektes sollen aus hES-Zellen gewonnene humane neurale Zellen genutzt werden, um Parameter für die Bestimmung der Neurotoxizität von potentiell neurotoxischen Substanzen zu erarbeiten und zu überprüfen. Dies dient der Aufklärung von molekularen Mechanismen der Wirkung toxischer Substanzen auf neurale Zellen des Menschen. Weiteres Ziel ist die Klärung der Fragestellung, ob auf der Basis von aus hES-Zellen differenzierten neuralen Zellen verbesserte Testsysteme zur Bestimmung neurotoxischer Eigenschaften, beispielsweise von Arzneimitteln, möglich sind und welche Endpunkte für die Bestimmungen von Neurotoxizität genutzt werden können. Diese Frage soll sowohl mit Blick auf die Wirkung von neurotoxischen Substanzen auf reife neurale Zellen des Menschen (Neuronen, Astrozyten sowie Mischkulturen aus beiden Zelltypen) als auch hinsichtlich der Wirkung von embryo-neurotoxischen Substanzen auf sich aus hES-Zellen differenzierende neurale Zellen untersucht werden, wobei auch Vergleiche mit Ergebnissen aus dem Embryonalen Stammzelltest (EST) geplant sind, in dem sich differenzierende embryonale Stammzellen der Maus für Toxizitätsprüfungen verwendet werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegungen dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Instituts (RKI) hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn in der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung medizinischer Kenntnisse bei der Entwicklung präventiver Verfahren zur Anwendung bei Menschen.

Gegenstand der Forschungsarbeiten ist zunächst die Untersuchung molekularer Prozesse während der Differenzierung von hES-Zellen zu neuralen Stammzellen sowie – im weiteren Verlauf – zu neuronalen bzw. astro-glialen Vorläuferzellen und Neuronen bzw. Astrozyten. Die vorgesehenen vergleichenden Genexpressionanalysen können dazu beitragen, Moleküle und Signalwege zu identifizieren, die während dieser mehrstufigen Differenzierungsprozesse eine Rolle spielen. Mittelbar sind aus den erwarteten Ergebnissen auch Erkenntnisse über molekulare Vorgänge zu erwarten, die während der neuralen Entwicklung im menschlichen Embryo eine Rolle spielen. Ferner können die geplanten Studien dazu beitragen, die Differenzierungsprotokolle für die Gewinnung von neuralen Zellen aus hES-Zellen zu optimieren und gegebenenfalls stabile Kulturen von humanen neuralen Stamm- und Vorläuferzellen zu etablieren, aus denen reproduzierbar menschliche Neuronen und Astrozyten in hoher Qualität gewonnen werden können, ohne dass dabei wiederholt auf hES-Zellen zurückgegriffen werden muss. Protokolle, die zu ausreichend großen Mengen humaner neuraler Zellen führen, könnten mittelfristig für Toxizitätsstudien und für die regenerative Medizin von Bedeutung sein.

Die Untersuchungen zu Wirkungen neurotoxischer Substanzen auf menschliche Neuronen und Astrozyten können vermutlich einen wesentlichen Beitrag dazu leisten, das Verständnis von Wirkmechanismen neurotoxischer Substanzen im menschlichen Gehirn zu verbessern. So sollen beispielsweise Erkenntnisse über die Wechselwirkung zwischen Neuronen und Astroglia infolge der Wirkung neurotoxischer Substanzen gewonnen werden. Ferner soll im genehmigten Vorhaben geklärt werden, ob und in wie weit aus hES-Zellen differenzierte bzw. sich differenzierende neurale Zellen zur Untersuchung von Neurotoxizität und Embryo-Neurotoxizität geeignet sind. Der geplante Vergleich von im beantragten Projekt gewonnenen Daten mit Daten aus dem auf murinen ES-Zellen beruhenden embryonalen Stammzelltest (EST) kann Aufschluss darüber erbringen, ob und in welchem Maße ein auf humanen Zellen basierendes In-vitro-Testsystem geeignet sein könnte, zusätzliche und neue Erkenntnisse über ent­wicklungstoxische Eigenschaften von Substanzen zu erbringen. Die beantragten Arbeiten könnten somit langfristig zur Schaffung der Grundlagen für verbesserte und komplexere Testsysteme zur Überprüfung von potentieller Neurotoxizität von Wirkstoffen und Chemikalien, als sie derzeit verfügbar sind, beitragen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass die im genehmigten Projekt vorgesehenen Fragestellungen an anderen als hES-Zellen bereits vorgeklärt worden sind, beispielsweise an ES-Zellen der Maus. Protokolle zur Differenzierung von murinen ES-Zellen zu neuralen Stamm- und Vorläuferzellen sind aus der Literatur hinlänglich bekannt, Ergebnisse der Untersuchungen zu molekularen Vorgängen während der neuralen Differenzierung muriner ES-Zellen wurden ebenfalls dargelegt. Aus murinen ES-Zellen differenzierte Zellen wurden und werden in verschiedenen Tests zur Bestimmung von Toxizität und Embryotoxizität verwendet, wobei auch neural differenzierte murine ES-Zellen bereits zum Einsatz kamen. Weiterhin existiert ein großer Satz von Daten aus In-vivo-Studien zur Entwicklungstoxizität, auf deren Basis Referenzsubstanzen für die Entwicklung von In-vitro-Tests zur Beurteilung von Entwicklungstoxizität erstellt wurden. Die im Maus-System verwendeten Protokolle für neurale Differenzierung sind zudem zwischenzeitlich von verschiedenen Gruppen auf hES-Zellen übertragen worden. In vitro aus hES-Zellen differenzierte Neuronen wurden bereits von anderen Gruppen für die Klärung spezifischer Fragestellungen in Toxizitätstest verwendet.

Die Notwendigkeit der Verwendung humaner ES-Zellen ergibt sich, wie im Antragsverfahren dargelegt wurde, aus spezies-spezifischen Besonderheiten der frühen neuralen Entwicklung, die sich im Menschen spezifisch und anders als in anderen Säugerspezies vollzieht. Die Identifizierung beteiligter Moleküle und Signalwege ist folglich nur an menschlichen Zellen möglich. Ferner können Aussagen über neurotoxische Effekte im Menschen und die zugrunde liegenden Wirkungsmechanismen zuverlässiger getroffen werden, wenn die Untersuchungen an humanen Zellen erfolgt. In der Zellbiologie des Gehirns, und hier besonders auch in der Kommunikation verschiedener Nervenzellen untereinander, bestehen erhebliche Unterschiede zwischen Tier und Mensch. Diese liegen zum einen in der unterschiedlichen Ausstattung neuraler Zellen verschiedener Spezies mit Enzymen bzw. deren Regulation, zum anderen in der unterschiedlichen Wirkung von extrazellulären Signalen, beispielsweise in Folge unterschiedlicher Rezeptor-Ausstattung der Zellen. Im Antragsverfahren wurde eine Reihe von Beispielen angeführt, in denen aufgrund unterschiedlicher molekularer Eigenschaften muriner und humaner Zellen Aussagen über die Toxizität bestimmter Substanzen im Menschen eindeutig nicht auf Grundlage von Daten aus murinen Zellen oder aus dem Mausmodell getroffen werden können.

Ferner können weder primäre Nervenzellen noch neurale oder andere adulte Stammzellen frühe Prozesse der humanen neuralen Differenzierung, wie sie im Projekt untersucht werden sollen, nachbilden. Das formulierte Forschungsziel kann nur unter Nutzung von hES-Zellen erfolgen. Eine Nutzung fötaler neuraler Stammzellen für die Untersuchung der Effekte toxischer Substanzen auf spätere Schritte der neuralen Differenzierung wäre theoretisch zwar denkbar. Dies würde jedoch die wiederholte Verwendung mehrerer menschlicher Gehirne aus simultan abgetriebenen Föten verlangen, was mit erheblichen Problemen verbunden wäre.

Im Antragsverfahren wurde weiterhin dargelegt, dass valide Aussagen über Neurotoxizität reproduzierbar eine ausreichende Mengen an Zellen erfordern, die humanen neuralen Zellen möglichst weitgehend gleichen. Permanente humane neurale Zellinien wurden meist aus Tumoren gewonnen und sind genetisch instabil. Sie weisen überdies nicht mehr die normale Physiologie humaner neuraler Zellen auf. Dies trifft auch auf Zell-Linien zu, die durch Immortalisierung von neuralen Zellen etabliert wurden. Primäre Zellen aus Hirngewebe sind in Kultur nicht vermehrbar, zudem ist ihre Gewinnung mit erheblichen Problemen verbunden. Neurale Stammzellen des Menschen sind derzeit ebenfalls nicht in ausreichenden Mengen verfügbar, und Methoden für ihre effiziente In-vitro-Kultivierung sind derzeit nicht etabliert. Die Transdifferenzierung anderer adulter Stammzelltypen des Menschen in neurale Zellen ist zwar verschiedentlich in der Literatur beschrieben worden, jedoch ist das Konzept der Transdifferenzierung  nach wie vor strittig, und die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht geklärt.

Die im November 2007 erstmals beschriebene Gewinnung induzierter pluripotenter Stammzellen des Menschen (iPS-Zellen) steht der Verwendung von hES-Zellen im genehmigten Projekt nicht entgegen. Derzeit ist nicht geklärt, ob induzierte pluripotente Zellen bezüglich ihres neuronalen Differenzierungspotentials humanen ES-Zellen vergleichbar sind. So zeigten in einer der Studien beispielsweise 2 von 4 untersuchten Zell-Klonen, die aus postnatalen Fibroblasten abgeleitet worden waren, im embryoid body keine neuroektodermale Differenzierung. Neurale Differenzierung unter Nutzung spezifischer Differenzierungsprotokolle wurde bislang für diese Zellen nicht untersucht. Hinzukommt, dass die bislang (theoretisch) verfügbaren Linien mehrere Gene enthalten, deren Einfluss auf die Biologie dieser Zellen offen ist. Ferner ist gegenwärtig ebenfalls nicht geklärt, ob die teilweise beobachtete deutliche Über- oder Unter-Expression zahlreicher Gene in iPS-Zellen im Vergleich zu hES-Zellen veränderte Eigenschaften in diesen Zellen bedingen könnten, die sich gegebenenfalls auch auf deren neurales Entwicklungsvermögen auswirkt.

nach oben