16. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Professor Dr. Sigurd Lenzen (Institut für Klinische Biochemie der Medizinischen Hochschule Hannover)

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten basieren auf humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) der folgenden Linie:

• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)

Im Rahmen der Erweiterung der Genehmigung vom 06.03.2009, 15.05.2009 und 31.10.2012 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen folgender weiterer Linien genehmigt:

• HES-3 (ES Cell International Pte. Ltd, Singapur)
• HES-4 (ES Cell International Pte. Ltd, Singapur)
• HUES4 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES8 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• Shef-1 (University of Sheffield, Großbritanien)
• Shef-2 (University of Sheffield, Großbritanien)
• Shef-3 (University of Sheffield, Großbritanien)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand des Forschungsvorhabens ist die Differenzierung, Anreicherung und Charakterisierung von insulinproduzierenden Zellen mit Charakteristika pankreatischer Beta-Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen).

Für die Differenzierung von hES-Zellen zu insulinproduzierenden Zellen mit Charakteristika pankreatischer Beta-Zellen ist die Übertragung eines im Labor des Genehmigungsinhabers an murinen embryonalen Stammzellen entwickelten Protokolls auf hES-Zellen vorgesehen. Da der Genehmigungsinhaber – analog zu den im murinen System erhaltenen Ergebnissen – dabei nur eine geringe Ausbeute spezifisch differenzierter Zellen erwartet, sollen differenzierte Zellen mit Charakteristika von Beta-Zellen in einem zweiten Schritt angereichert werden. Die Anreicherung erfolgt anhand eines spezifisch in pankreatischen Vorläuferzellen exprimierten Reportergens, das vor Beginn der Differenzierung in die hES-Zellen eingebracht werden soll. Die angereicherten Zellen sollen dann hinsichtlich ihrer molekularen und morphologischen Charakteristika sowie bezüglich funktioneller Eigenschaften untersucht werden, die für Beta-Zellen typisch sind.

Bei dem Forschungsvorhaben wird mit einer voraussichtlichen Dauer von 3 Jahren gerechnet.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend den im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegungen sollen die Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Erweiterung medizinischer Kenntnisse bei der Entwicklung therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen dienen.

Für die Begründung der Hochrangigkeit des Forschungszieles sind folgende Gründe maßgeblich: Die Verfügbarkeit von Zellen, die wesentliche Eigenschaften humaner pankreatischer Beta-Zellen aufweisen, wird als Vorraussetzung für eine künftige Zellersatztherapie zur Behandlung des Diabetes mellitus angesehen. Methoden für eine Gewinnung ausreichender Mengen solcher Zellen sind gegenwärtig nicht etabliert. Im genehmigten Projekt soll nun überprüft werden, ob ein vom Genehmigungsinhaber an murinen Zellen erfolgreich etabliertes Anreicherungsverfahren für Beta-Zell-ähnliche Zellen auf humane ES-Zellen übertragen werden kann. Im Falle der erfolgreichen Durchführung des Projektes stünden Beta-Zell-ähnliche Zellen zur Verfügung, die – zunächst in vitro - hinsichtlich ihrer grundsätzlichen Eignung für Zellersatztherapien zur Behandlung des Diabetes mellitus untersucht werden können. Insofern könnten sich wichtige neue Erkenntnisse über die Eignung von Methoden und Verfahren zur Anreicherung von humanen insulinproduzierenden Zellen mit Charakteristika pankreatischer Beta-Zellen ergeben.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurden umfangreiche eigene Arbeiten zur Vorklärung der experimentellen Fragestellung dargelegt. Das Protokoll zur Differenzierung und Anreicherung von insulinproduzierenden Zellen mit Eigenschaften pankreatischer Beta-Zellen wurde an murinen ES-Zellen etabliert und die angereicherten Zellen als insulinproduzierende Zellen mit wesentlichen Eigenschaften pankreatischer Beta-Zellen identifiziert. Die geplante Vorgehensweise ist ausreichend experimentell vorgeklärt worden.

Das Projektziel, humane insulinproduzierende Zellen mit Charakteristika von Beta-Zellen durch Differenzierung und Anreicherung aus Stammzellen zu gewinnen und diese bezüglich für Beta-Zellen relevanter Eigenschaften zu charakterisieren, lässt sich nach derzeitigem Kenntnisstand voraussichtlich nur mit hES-Zellen realisieren. Die Nutzung von Stammzellen aus einer anderen Quelle – beispielsweise pankreatischer Vorläuferzellen, deren spezifische Charakteristika zudem noch nicht eindeutig bestimmt bzw. in der wissenschaftlichen Debatte umstritten sind – ist für das Projekt nach gegenwärtigem Stand der Wissenschaft nicht möglich.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 11.03.2010

Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Gegenstand der zusätzlich genehmigten Arbeiten ist die Entwicklung und Erprobung eines experimentellen Ansatzes für die gezielte Zerstörung undifferenzierter embryonaler Stammzellen in Populationen bereits differenzierter Zellen, die aus hES-Zellen abgeleitet wurden. Dazu soll ein sogenanntes Suizid-Gen (hier das Gen für die Thymidin-Kinase des Herpes Simplex-Virus) unter Kontrolle des nur in pluripotenten (undifferenzierten) Stammzellen exprimierten Gens für den Transkriptionsfaktor oct4 in Verbindung mit dem Gen für grün fluoreszierendes Protein (GFP) in hES-Zellen eingeschleust werden. Zellklone, die das eingeschleuste Gen enthalten, sollen selektiert, angereichert und zu pankreatischen Beta-Zellen differenziert werden. Anschließend sollen verbliebene undifferenzierte Zellen durch Behandlung mit dem Nukleotid-Analogon Ganciclovir selektiv eliminiert werden. Die mit Ganciclovir behandelten Zellpopulationen sollen dann in vitro umfassend charakterisiert und mit unbehandelten Zellen insbesondere im Hinblick auf ihr Potential zur Teratom-Bildung in Mäusen verglichen werden. Der Ansatz soll dann auch auf die pankreatische Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) übertragen werden.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Gegenwärtig verfügbare Verfahren für die pankreatische Differenzierung von hES-Zellen führen nicht zu Zellpopulation, die frei von undifferenzierten hES-Zellen sind. Ziel der genehmigten Arbeiten ist es, differenzierte Zellpopulationen von verbliebenen undifferenzierten Zellen zu befreien, die potentiell zur Bildung von Teratomen führen könnten. Dies ist sowohl im Hinblick auf eine möglichst hohe Reinheit von Zellpopulationen für Fragestellungen der Forschung als auch bezüglich einer künftig denkbaren klinischen Anwendung von aus hES-Zellen differenzierten pankreatischen Zellen von Bedeutung. Der Genehmigungsinhaber wendet sich damit der Lösung eines grundsätzlichen Problems zu, das einer künftigen klinischen Verwendung von aus pluripotenten Zellen abgeleiteten differenzierten Zellen im Wege steht. Im Erfolgsfalle könnte der gewählte experimentelle Ansatz auch bei der Differenzierung von hES-Zellen in andere als pankreatische Zellen eingesetzt werden; er wäre überdies auch auf die Differenzierung von hiPS-Zellen übertragbar. Das Risiko von in differenzierten Derivaten verbliebenen hiPS-Zellen, nach Transplantation in Versuchstiere unlimitiert zu proliferieren und gegebenenfalls Tumoren zu bilden, ist bislang nicht untersucht worden, jedoch besteht dieses potentielle Risiko für hiPS-Zellen ebenso wie für hES-Zellen.

Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass die an hES-Zellen geplanten Experimente bereits unter Nutzung muriner ES-Zellen durchgeführt worden sind. In entsprechenden Experimenten konnte u. a. gezeigt werden, dass die für hES-Zellen geplante experimentelle Vorgehensweise zu einer starken Verminderung der Zahl undifferenzierter Zellen innerhalb pankreatisch differenzierter muriner Zellpopulationen führte. Ferner war, wie es auch für hES-Zellen postuliert wird, die Größe der Teratome, die nach Transplantation von aus murinen ES-Zellen gewonnenen pankreatischen Zellen in Mäusen gebildet wurden, deutlich vermindert; bei Weiterbehandlung mit Ganciclovir nach Transplantation konnte die Teratombildung vollständig unterdrückt werden.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt. Ziel des Gesamtvorhabens ist die Etablierung von neuen Protokollen zur Gewinnung menschlicher Beta-Zellen. Dabei richtet sich das Interesse des Genehmigungsinhabers auf die Schaffung von Grundlagen für eine künftig denkbare Gewebeersatztherapie unter Nutzung solcher aus hES-Zellen differenzierter Zellen. Dem Erreichen dieses Forschungsziels dienen auch die nun genehmigten, das bereits genehmigte Projekt erweiternden Arbeiten. Die bei der Genehmigung des ursprünglichen Vorhabens angeführten Gründe dafür, dass der angestrebte wissenschaftliche Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichbar ist, gelten weiterhin. Der Wissensstand über adulte pankreatische Vorläuferzellen des Menschen, die gegebenenfalls anstelle von hES-Zellen als Ausgangsmaterial für die Differenzierung zu Beta-Zellen genutzt werden könnten, ist in den hier relevanten Aspekten im wesentlichen unverändert. Die seit kurzem verfügbaren hiPS-Zellen sind bezüglich ihres pankreatischen Differenzierungspotentials erst in Ansätzen untersucht worden, und insbesondere Daten zu den In-vivo-Eigenschaften entsprechend differenzierter Zellen sind bislang nicht publiziert worden.

Genehmigungserweiterung vom 31.10.2012

Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Gegenstand der genehmigten Arbeiten ist die Entwicklung und Erprobung eines Verfahrens, bei dem eine für pankreatische Zellen spezifische Reportergenexpression zur Aufreinigung von Subpopulationen pankreatischer (Vorläufer)Zellen genutzt werden soll. Dazu sollen hES-Zellen mit Expressionskassetten für Reportergene versehen werden, in denen die Expression des Reportergens durch Promotoren kontrolliert wird, die in sich entodermal bzw. pankreatisch differenzierenden Zellen aktiv sind. Die so modifizierten hES-Zellen sollen dann Standardprotokollen für die entodermale bzw. pankreatische Differenzierung unterworfen werden, und Populationen von Vorläuferzellen sollen auf Grundlage der jeweils beobachteten Reportergenexpression angereichert werden. Um eine erwartete unspezifische Aktivierung des Reportergens zu vermindern, sollen ggf. Bindestellen für  bestimmte mikro-RNAs (miRNAs) in die Expressionskassetten eingebaut werden, die die Expression des Reportergens in nicht differenzierten Zellen verhindern sollen. Dazu soll im Vorfeld bestimmt werden, welche miRNAs im Laufe der pankreatischen Differenzierung humaner ES-Zellen auftreten. Die differenzierten (Vorläufer)Zell-Populationen sollen anschließend umfassend in vitro charakterisiert und schließlich in immundefiziente diabetische Mäuse transplantiert werden, um ihre Funktionalität in vivo zu testen.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Trotz weltweiter Bemühungen, Protokolle zur Gewinnung von pankreatischen Beta-Zellen aus hES-Zellen zu entwickeln, gibt es weiterhin kein publiziertes bona fide-Protokoll zur Gewinnung pankreatischer Beta-Zellen aus pluripotenten Stammzellen des Menschen. Im Rahmen der genehmigten Arbeiten sollen nun neue Vorgehensweisen erprobt werden, um möglichst reine Populationen funktionsfähiger pankreatischer Beta-Zellen gewinnen zu können. Das Ziel des Forschungsvorhabens besteht unverändert in der Entwicklung und Optimierung von  Methoden zur Gewinnung humaner pankreatischer Zellen für einen späteren Einsatz in der Gewebeersatztherapie, und die in 4. benannten Hochrangigkeitsgründe bestehen angesichts des derzeitigen Forschungsstandes unverändert fort. Um für den hier genehmigten spezifischen experimentellen Ansatz geeignete miRNAs zu identifizieren, sollen zudem Expressionsprofile von miRNAs während der pankreatischen Differenzierung von hES-Zellen bestimmt werden. Daraus können sich ggf. neue und wichtige Erkenntnisse über die Präsenz spezifischer miRNAs während bestimmter Phasen der pankreatischen Differenzierung humaner ES-Zellen ergeben, woraus unter Umständen Rückschlüsse auf die Funktion der entsprechenden miRNAs während der Pankreasentwicklung beim Menschen gezogen werden können.

Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Der geplante experimentelle Ansatz der sog. lineage selection, d. h. die Anreicherung von sich differenzierenden Zellen auf Grundlage einer für das entsprechende Differenzierungsstadium charakteristischen Reportergenexpression, ist für die Differenzierung von hES-Zellen gut etabliert und wurde für die Entwicklung verbesserter Protokolle zur pankreatischen Differenzierung von hES-Zellen bereits mehrfach beschrieben.

Ferner wurden vom Genehmigungsinhaber umfangreiche eigene Voruntersuchungen zur Expression von miRNAs in sich pankreatisch differenzierenden murinen ES-Zellen durchgeführt. Auf deren Grundlage wurde die hier für die Differenzierung humaner ES-Zellen geplante Strategie zur Verminderung der erwarteten unspezifischen Reportergenaktivität im murinen Zellkultursystem entwickelt, und die grundsätzliche Funktionsfähigkeit des geplanten experimentellen Vorgehens wurde im Mausmodell nachgewiesen. Auch die geplanten Vorgehensweisen zur Anreicherung von Zellen auf Grundlage der Aktivität von Reportergenprodukten, die Methoden zur In-vitro-Charakterisierung der differenzierten Zellen sowie das Vorgehen zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit der pankreatisch differenzierten Zellen in vivo sind durch Arbeiten des Genehmigungsinhabers selbst sowie durch entsprechende Veröffentlichungen in der Literatur ausreichend vorgeklärt.

Ferner wurde dargelegt, dass zur Erreichung der im Antrag benannten wissenschaftlichen Zielstellungen auch weiterhin hES-Zellen benötigt werden. Ziel des genehmigten Vorhabens ist die Etablierung von verbesserten Protokollen zur Gewinnung hinreichend reiner Populationen menschlicher Beta-Zellen, die künftig für therapeutische Zwecke beim Menschen verwendet werden sollen. Für die Erreichung dieses Forschungsziels sind tierische Zellen auch weiterhin nicht geeignet. Ferner sind auch weiterhin keine wesentlichen Fortschritte bei der Differenzierung adulter pankreatischer Vorläuferzellen des Menschen zu verzeichnen. Eine Transdifferenzierung adulter Zellen in pankreatische Zellen ist ebenfalls nicht beschrieben; selbst wenn dies gelänge, bliebe die wesentliche Frage offen, ob hierdurch die für die künftig angestrebte Gewebeersatztherapie erforderlichen Zellmengen gewonnen werden könnten. In Bezug auf hiPS-Zellen, durch deren Verwendung möglicherweise die formulierten Forschungsziele ebenfalls erreicht werden könnten, wurde dargelegt, dass mittlerweile zahlreiche Unterschiede zwischen hES- und hiPS-Zellen beschrieben wurden, beispielsweise bezüglich ihres epigenetischen Status und ihrer genetischen Eigenschaften. Zudem gibt es deutliche Hinweise auf ein somatisches Gedächtnis bei hiPS-Zellen, was Fragen zur pankreatischen Differenzierungsfähigkeit von üblicherweise aus Hautzellen gewonnenen hiPS-Zellen aufwirft. Zwar liegen mittlerweile verschiedene Arbeiten zur pankreatischen Differenzierung von hiPS-Zellen vor. Jedoch sind die Befunde zum entsprechenden Differenzierungspotential teils unterschiedlich, und selbst hiPS-Zell-Linien aus demselben Labor weisen teils deutliche Schwankungen in ihrer Fähigkeit auf, sich zu Beta-Zellen zu entwickeln. Folglich kann derzeit nicht eingeschätzt werden, ob und inwieweit sich hES- und hiPS-Zellen bezüglich ihres pankreatischen Differenzierungspotentials gleichen oder unterscheiden.

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