8. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaberin

Frau Dr. Katrin Zeilinger (Bioreactor Group, Berlin Brandenburg Center for Regenerative Therapies (BCRT), Charité Campus Virchow-Klinikum, Berlin)

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten basieren auf humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) der folgenden Linien:

• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• SA001 (Cellartis AB, Göteborg, Schweden)
• SA002 (Cellartis AB, Göteborg, Schweden)

Im Rahmen der Erweiterung der Genehmigung vom 16.07.2009 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen folgender weiterer Linien genehmigt.

• SA121 (Cellartis AB, Göteborg, Schweden)
• SA167 (Cellartis AB, Göteborg, Schweden)
• SA181 (Cellartis AB, Göteborg, Schweden)
• SA348 (Cellartis AB, Göteborg, Schweden)
• SA461 (Cellartis AB, Göteborg, Schweden)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Für Forschungsarbeiten unter dem Titel „Entwicklung eines 3D-Kultursystems für die Expansion humaner embryonaler Stammzellen und deren Differenzierung in Leberzellen“ wurde die Einfuhr und Verwendung der oben genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien genehmigt.

Das Ziel des Forschungsvorhabens besteht in der Entwicklung und Etablierung eines dreidimensionalen (3D)-Systems für die Kultivierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und deren Differenzierung zu Hepatozyten.

Dabei sollen hES-Zellen, basierend auf den Erfahrungen mit anderen Zelltypen, in einem Vierkompartment-Bioreaktor vermehrt und die Bedingungen für ihre Vermehrung optimiert werden. Dies soll sowohl in Anwesenheit von feeder-Zellen als auch unter feeder-Zell-freien Bedingungen erfolgen. Die Qualität der Zellen soll fortlaufend überprüft und ein Verfahren für die möglichst schonende Entnahme der hES-Zellen aus dem Bioreaktor entwickelt und optimiert werden.

Die im Bioreaktor amplifizierten hES-Zellen sollen dann im Kontext des 3D-Systems zu Hepatozyten differenziert werden. Dazu werden verschiedene Kombinationen von Wachstumsfaktoren und/oder konditionierte Medien genutzt, ausgehend von solchen, die bereits für diese Zwecke verwendet und publiziert wurden. Das Vorliegen hepatischer Vorläuferzellen bzw. reifer Hepatozyten soll durch morphologische, funktionelle (biochemische) und zellbiologische Charakterisierung der entstandenen Zellpopulation nachgewiesen werden. Die mit hES-Zellen gewonnenen Ergebnisse sollen mit Resultaten aus Versuchen verglichen werden, in denen anstelle von hES-Zellen somatische Stammzellen der Leber bzw. multipotente Nabelschnur-Stammzellen des Menschen unter den Bedingungen des 3D-Systems kultiviert und zu Hepatozyten differenziert werden.

Im Rahmen des Projektes ist weiter vorgesehen, den Bioreaktor für die Kultivierung bzw. Differenzierung von hES-Zellen hinsichtlich verschiedener Parameter zu optimieren und Voraussetzungen für eine mögliche Überführung der Forschungsergebnisse in die klinische Anwendung die Vermehrung und Differenzierung der hES-Zellen in größeren Prototypen des Bioreaktors zu etablieren.

Bei dem Forschungsvorhaben wird mit einer voraussichtlichen Dauer von 5 Jahren gerechnet.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die vorgesehenen Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung und für die Erweiterung medizinischer Erkenntnisse bei der Entwicklung eines therapeutischen Verfahrens zur Anwendung bei Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Im Rahmen dieser Forschung sollen erstens Erkenntnisse über die Faktoren und sonstigen Bedingungen gewonnen werden, die eine optimale Expansion von hES-Zellen unter 3D-Bedingungen ermöglichen. Dies ist - besonders im Hinblick auf die eingeschränkte Verfügbarkeit von hES-Zellen - ein wesentlicher Beitrag zur Entwicklung der hES-Zell-Technologie. Der Vergleich mit unter zweidimensionalen Bedingungen kultivierten Zellen lässt voraussichtlich Rückschlüsse auf mögliche qualitative Effekte der Kulturbedingungen auf biologische Eigenschaften der Zellen zu. Die Testung der Kultivierbarkeit von hES-Zellen ohne Zusatz von tierischen Seren und ohne Ko-Kultur mit feeder-Zellen ist im Hinblick auf eine potentielle klinische Nutzung dieser Zellen und ihrer Derivate ebenfalls von erheblicher Bedeutung.

Zweitens werden aus dem Projekt Erkenntnisse darüber erwartet, ob und auf welchem Wege die Differenzierung von hES-Zellen zu Hepatozyten im Kontext eines dreidimensionalen Systems erfolgen kann. Die Nutzung eines dreidimensionalen Systems für die Differenzierung lässt möglicherweise eine bessere Simulation der In-vivo- Hepatogenese bzw. Leberregeneration zu als herkömmliche zweidimensionale Differenzierungssysteme. Daraus sind Erkenntnisse über den physiologischen Ablauf der Prozesse bei der Differenzierung im Laufe der Leberentwicklung und -regeneration zu erwarten.

Die vergleichende Untersuchung des Phänotyps von hepatischen zellen, die aus hES-Zellen, humanen Leberstammzellen oder multipotenten Stammzellen des Nabelschnurblutes jeweils unter dreidimensionalen Bedingungen abgeleitet werden sollen, lässt drittens Erkenntnisse über die Eignung verschiedener Stammzelltypen für die Differenzierung zu Hepatozyten erwarten. Gemeinsamkeiten und Unterschiede im Entwicklungspotential dieser Zelltypen sind voraussichtlich ebenfalls aus diesen Experimenten ableitbar.

Das im Rahmen des Projektes zu entwickelnde 3D-System für die Differenzierung von hES-Zellen zu Hepatozyten könnte eine therapeutische Perspektive für ein künftig klinisch einsetzbares System bieten, das z.B. im Falle eines Leberversagens für eine vorübergehende, extrakorporale Leberunterstützung genutzt werden könnte. Ein vergleichbarer Bioreaktor, befüllt mit adulten humanen Hepatozyten, wurde vom Antragsteller im Rahmen medizinischer Forschung mehrfach erfolgreich in der Klinik eingesetzt. Der Mangel an geeignetem Zellmaterial für die Befüllung des Bioreaktors ist gegenwärtig das Haupthindernis für einen breiteren Einsatz eines solchen Systems. Die Breitstellung eines mit funktionsfähigen humanen Hepatozyten befüllten Bioreaktors zur Aufrechterhaltung der Leberfunktion stellt daher ein hochrangiges Forschungsziel im Rahmen der Erweiterung von Kenntnissen bei der Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren dar.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Die Eignung der im Projekt verwendeten Vierkomponenten-Bioreaktoren für die Leberzellkultivierung ist durch Veröffentlichungen, auch des Genehmigungsinhabers selbst, belegt und somit vorgeklärt. Die Bioreaktoren wurden bislang mit Zellmaterial aus verschiedenen Quellen (z.B. mit primären humanen Hepatozyten, primären Schweine-Hepatozyten) befüllt und in einigen Fällen bereits experimentell in der Klinik verwendet. Die für das Projekt vorgesehenen Methoden zur Charakterisierung von humanen Hepatozyten hinsichtlich morphologischer, biochemischer und molekularer Marker sind etabliert. Die Kultivierung muriner embryonaler Stammzellen mES-Zellen unter den Bedingungen des Bioreaktors wurde vom Genehmigungsinhaber im Vorfeld der Antragstellung ebenfalls erfolgreich durchgeführt und im Antragsverfahren dokumentiert. Die Differenzierung von mES-Zellen zu Hepatozyten im 2D-System ist bereits mehrfach in der internationalen Literatur publiziert worden. Weiterhin liegen bereits Studien vor, in denen hES-Zellen selbst zu hepatischen Vorläuferzellen differenziert wurden.

Um die Bedingungen für die Kultivierung und hepatische Differenzierung von hES-Zellen im dreidimensionalen System zu etablieren und zu optimieren, ist wegen der wesentlich unterschiedlichen Kulturbedingungen für tierische ES-Zellen die Verwendung von hES-Zellen selbst notwendig. Auch das Ziel, mittelfristig ein System für den vorübergehenden Ex-vivo-Leberersatz zur Verfügung zu stellen, erfordert die Verwendung humaner Zellen, da ein solches System aus Gründen der Biosicherheit, aber auch der artspezifischen Leberzellleistungen, nicht auf Leberzellen einer tierischen Spezies basieren kann.

Die Notwendigkeit der Nutzung von hES-Zellen ergibt sich weiterhin aus der zu untersuchenden Fragestellung, welche Faktoren an der Differenzierung von hES-Zellen zu Hepatozyten eine Rolle spielen und wie dieser Prozess in vitro optimiert werden kann. Diese Fragestellung kann nicht unter Verwendung alternativen Materials, beispielsweise adulter hepatischer Stammzellen oder multipotenter Stammzellen aus dem Knochenmark untersucht werden, da diese Zellen nach gegenwärtig herrschender Auffassung über ein nur eingeschränktes Entwicklungspotential verfügen, das ihre Fähigkeit, Leberzellen zu bilden, begrenzt.

In dem Projekt sollen ferner die Eigenschaften von aus hES-Zellen abgeleiteten Hepatozyten mit denen solcher Hepatozyten verglichen werden, die möglicherweise aus Nabelschnurblut bzw. adulten Leberstammzellen abgeleitetet werden können. Dieser Vergleich erfordert zwingend die Verwendung von hES-Zellen.

Die Nutzung von zu hES-Zellen alternativen humanen Zellen für die Entwicklung eines dreidimensionalen Systems für einen extrakorporalen Leberersatz ist gegenwärtig ebenfalls nicht möglich, vor allem aber nicht sinnvoll, da die Optimierung des Systems auf den Zelltyp abzustimmen ist, der im Falle einer künftigen Anwendung als Ausgangsmaterial erforderlich wäre. Dies könnten nach derzeitigem Kenntnisstand nur hES-Zellen sein, da die für eine therapeutische Zielsetzung erforderlichen Ausgangsmengen an anderen Zellen, beispielsweise primören Hepatozyten, nicht zur Verfügung stehen. Primäre Leberzellen haben eine sehr eingeschränkte Teilungsfähigkeit, transformierte humane Leberzellen erbringen nicht die für Leberzellen typischen Stoffwechselleistungen. Darüber hinaus lassen sich hepatische Stammzellen gegenwärtig nicht in ausreichender Menge und Qualität gewinnen und vermehren. Diese Argumente gelten in analoger Weise für humane fötale Zellen.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 15.09.2016

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Im Zuge der Durchführung der zuvor genehmigten Forschungsarbeiten hat sich gezeigt, dass bei der hepatischen Differenzierung erhebliche Veränderungen im Glykosylierungsmuster auftreten, die als Indikator des Voranschreitens der Differenzierung und ggf. als Marker für den Reifungsgrad der leberzellähnlichen Zellen dienen können. Aus diesem Grunde soll die Untersuchung von Veränderungen im Glykosylierungsmuster nunmehr in den Mittelpunkt der Analyse des Differenzierungsprozesses gerückt und hepatische Zellen von verschiedenen Stadien ihrer Entwicklung umfassend hinsichtlich spezifischer Glykosylierungen untersucht werden. Ferner sollen Strategien entwickelt werden, um hepatische (Vorläufer)Zellen auf der Grundlage ihres spezifischen  Glykosylierungsmusters anzureichern. Zudem soll die hepatische Differenzierung von hES-Zellen vergleichend mit jener von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) durchgeführt werden.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen in erster Linie hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Die Hochrangigkeit der Forschungsziele, die im ursprünglichen Antragsverfahren formuliert wurden, besteht weiterhin. Trotz intensiver internationaler Forschung ist es bislang nicht gelungen, aus pluripotenten Stammzellen in vitro humane Leberzellen zu gewinnen, die metabolische Eigenschaften im selben Umfang wie primäre menschliche Hepatozyten aufweisen. Solche Zellen werden aber vor allem für pharmakologisch-toxikologische Fragestellungen dringend benötigt. Der mit dem Vorhaben angestrebte  Erkenntnisgewinn über die Faktoren und sonstigen Bedingungen, die eine optimale Expansion von hES-Zellen und deren Differenzierung in leberzellähnliche Zellen ermöglichen, ist daher weiterhin von hoher Relevanz. Durch die geplante eingehende Analyse der Glykosylierungsmuster von Zellen, die eine hepatische Differenzierung durchlaufen, sollen nun zum einen grundlegende Erkenntnisse über die Veränderungen des Kohlenhydratmusters in verschiedenen Stadien der Leberzell-Differenzierung gewonnen werden. Dies kann Rückschlüsse auf die Rolle spezifischer Glykosylierungen in hepatischen Differenzierungsprozessen erlauben und in der Folge die Identifizierung von Enzymen und Faktoren ermöglichen, die nur in bestimmten Phasen des Differenzierungsprozesses aktiv sind. Ferner können spezifische Glykosylierungsmuster auch als Endpunkte und somit als Qualitätsmarker für eine erfolgreiche hepatische Differenzierung genutzt werden. Durch die geplante vergleichende Untersuchung der Glykosylierungsmuster hES-Zell-abgeleiteter und primärer menschlicher Hepatozyten können zudem Erkenntnisse darüber entstehen, warum bisherige In-vitro-Differenzierungsstrategien nicht zu reifen Hepatozyten führen und wie die entsprechenden Vorgehensweisen ggf. modifiziert werden müssen. Schließlich können auf hepatischen Vorläuferzellen identifizierte Glykan-Muster zur Entwicklung von Protokollen für die gezielte Anreicherung bestimmter Vorläuferzellpopulationen genutzt und damit möglicherweise zur Verbesserung von Vorgehensweisen für die Bereitstellung humaner Leberzellen beigetragen werden.

Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Differenzierungsprozesse sind mit teils erheblichen Veränderungen in den Glykosylierungsmustern der Zellen verbunden. Dies gilt für die Bildung von embryoid bodies ebenso wie für die Differenzierung in mesenchymale und neuronale Zellen. Insofern ist es plausibel, Untersuchungen zu Veränderungen des Glykan-Musters auch an sich hepatisch differenzierenden humanen Stammzellen vorzunehmen. Spezifische Fragen zur Glykosylierung in menschlichen Zellen können zudem nicht in tierischen Zellkulturen untersucht werden, da es zahlreiche spezies-spezifische Glykosylierungen gibt. Eine weitergehende Vorklärung der wissenschaftlichen Fragestellungen unter Nutzung tierischer Zellen oder im Tiermodell kann daher voraussichtlich keinen für die zu klärenden Forschungsfragen relevanten Erkenntnisgewinn erbringen.

Die oben genannten Argumente zur Notwendigkeit der Ver­wendung von hES-Zellen gelten, was die mögliche alternative Nutzung tierischer und nicht-pluripotenter humaner Stammzellen betrifft, unverändert fort. Zur Frage, ob die Nutzung von hES-Zellen angesichts des Forschungsstandes zur hepatischen Differenzierung von hiPS-Zellen weiterhin erforderlich ist, wurde im Antragsverfahren dargelegt, dass erhebliche Unterschiede in der Fähigkeit verschiedener hiPS-Zell-Linien bestehen, sich in hepatische Zellen zu differenzieren. Dies kann ggf. durch Unterschiede in der Herkunft des somatischen Materials begründet sein. Linien-spezifische Unterschiede im Potential zur hepatischen Differenzierung waren in verschiedenen Studien berichtet worden, bei denen die hepatische Differenzierung mehrerer hiPS-Zell-Linien deutlich weniger homogen als jene von hES-Zellen war. Ferner gibt es widersprüchliche Resultate hinsichtlich des metabolischen Profils der aus hiPS-Zellen differenzierten hepatischen Zellen. Es besteht weiterhin keine Klarheit über die Ursachen für die Unterschiede im hepatischen Differenzierungspotential verschiedener pluripotenter Stammzell-Linien. Auch aus diesem Grunde ist es erforderlich, hiPS- und hES-Zellen bezüglich ihres hepatischen Differenzierungspotentials zu vergleichen. Dies erfordert die Nutzung von hES-Zellen.

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