2. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Professor Dr. Jürgen Hescheler (Institut für Neurophysiologie der Universität zu Köln)

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten basieren auf humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) der folgenden Linie:

• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)

Im Rahmen der Erweiterung der Genehmigung vom 14.08.2006 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen folgender weiterer Linien genehmigt:

• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H13 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-1 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-2 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)

Im Rahmen der Erweiterung der Genehmigung vom 02.04.2009 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen folgender weiterer Linien genehmigt:

• HS181 (Karolinska-Institute, Stockholm, Schweden)
• HUES1 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES2 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES4 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES8 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES10 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Für Arbeiten zum Thema vergleichender Untersuchungen humaner und muriner embryonaler Stammzellen bezüglich struktureller und funktioneller Eigenschaften während der Kardiomyogenese wurden die Einfuhr und Verwendung der oben genannten humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) genehmigt. Gegenstand der Arbeiten ist es, hES-Zellen in Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten) zu differenzieren und diese Zellen zu charakterisieren. Das Vorhaben soll dazu beitragen, grundlegende Mechanismen der Entwicklung von Kardiomyozyten aus hES-Zellen in vitro zu klären. Die Arbeiten umfassen Untersuchungen zu geeigneten Bedingungen für die Entwicklung von Kardiomyozyten aus humanen embryonalen Stammzellen, die Charakterisierung der dabei auftretenden kardialen Differenzierungsstadien, die Analyse der verschiedenen kardialen Subtypen sowie die Untersuchung der Signaltransduktionswege und der elektrophysiologischen Eigenschaften der differenzierten Zellen. Die geplante Charakterisierung hES-Zell abgeleiteter kardialer Zellen soll auf verschiedenen Ebenen, u.a. auf der Genexpressionsebene unter Nutzung von Genchipanalysen und auf der Funktionsebene unter Nutzung von Techniken wie patch clamp, micro electrode array und sharp electrode erfolgen. Ferner soll die funktionelle Integration der kardial differenzierten Zellen in In-vitro-Schnittkulturen von Mausherzen untersucht werden. Schwerpunkte der genehmigten Arbeiten liegen ferner auf der Identifizierung von Genen, die bei der Induktion der Differenzierung kardialer Zellen aus hES-Zellen eine Rolle spielen, und auf Untersuchungen zur Charakteristik der Aktionspotentiale, zur Regulation der Calzium-Homöostase während verschiedener Stadien der Differenzierung und zu den beteiligten Ionenkanälen und Signalübertragungswegen. Die untersuchten Parameter werden zwischen dem murinen und humanen System sowie zwischen verschiedenen Stadien der Herzdifferenzierung aus humanen ES-Zellen verglichen. Es ist vorgesehen, die gewonnenen Daten mit Daten von Zellen aus dem Gewebe erkrankter Herzen zu vergleichen. Für die pharmakologische Charakterisierung von aus hES-Zellen abgeleitetem Herzgewebe sollen auch verschiedene bekannte kardial wirkende Arzneimittel eingesetzt werden.

Bei dem Forschungsvorhaben wird mit einer voraussichtlichen Dauer von ca. 5 Jahren gerechnet.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Nach den im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegungen dienen die vorgesehenen Forschungsarbeiten an humanen embryonalen Stammzellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung.

Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Die Fragestellungen, die mit der Übertragung der an murinen embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) erarbeiteten Verfahren und Analysen auf hES-Zellen bzw. auf die aus ihnen differenzierten Kardiomyozyten verfolgt werden, sind innerhalb der Grundlagenforschung von essentieller Bedeutung. Die geplanten In-vitro-Versuche sollten es erlauben, Fragen nach den Faktoren und Bedingungen, die für die Ausbildung und Entwicklung von Kardiomyozyten beim Menschen zwingend erforderlich sind, zu beantworten. Durch die Untersuchungen der Bedingungen für die Herzzell-Differenzierung aus embryonalen Stammzellen sowie durch die Analyse der resultierenden, verschiedenen kardialen Subtypen lassen sich zusätzlich auch grundlegende Erkenntnisse im Hinblick auf die Regulation dieser komplexen und bisher noch nicht verstandenen Vorgänge während der Embryonalentwicklung beim Menschen gewinnen.

Das Wissen über die Bedingungen für eine effiziente kardiale Differenzierung ist eine wichtige Voraussetzung für die zukünftige Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung der Folgeschäden von Myokardinfarkten. Insofern ist das geplante Vorhaben potentiell auch von Relevanz für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze. Die Ergebnisse des genehmigten Projektes könnten auch zur Etablierung eines auf kardialen Zellen basierenden In-vitro-Testsystems beitragen, mit dessen Hilfe Aussagen über die Wirksamkeit von Wirkstoffen am Herzen bzw. über deren Kardiotoxizität gemacht werden könnten. Die o.g. konkreten Forschungsziele sind daher mittelfristig bzw. längerfristig potenziell auch für die Erweiterung medizinischer Erkenntnisse bei der Entwicklung diagnostischer, präventiver oder therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen relevant.

Die Wahl des Versuchsansatzes für die Umsetzung des angestrebten Zieles, hier: die Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen in funktionsfähige Kardiomyozyten, ist - ungeachtet aller gerade im Stadium der Grundlagenforschung unvermeidbaren Imponderabilien - im Antragsverfahren plausibel dargelegt und in ausführlichen Vorarbeiten an embryonalen Stammzellen der Maus untersucht und belegt worden. Es ist schlüssig dargelegt, dass es ihm in Voruntersuchungen an mES-Zellen gelungen ist, effektive Verfahren für die angestrebte gezielte Differenzierung embryonaler Stammzellen in Kardiomyozyten zu etablieren, diese Zellen zu gewinnen und ihre Charakteristika sowie ihr Verhalten in vitro zu untersuchen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Voruntersuchungen mit mES-Zellen zur Etablierung der Kulturbedingungen für die Differenzierung von embryonalen Stammzellen aus der Maus sind vom Genehmigungsinhaber selbst langjährig durchgeführt worden und waren die Grundlage für zahlreiche wissenschaftliche Veröffentlichungen . Dabei ist es gelungen, Kardiomyozyten in reiner Form zu gewinnen und zu charakterisieren.

Der Einsatz von humanen embryonalen Stammzellen ist voraussichtlich für die Erreichung des mit dem Forschungsvorhaben angestrebten Erkenntnisgewinns erforderlich.

Die Erprobung an murinen embryonalen Stammzellen stößt, nachdem der Untersuchungserfolg mit diesen erbracht wurde, an Grenzen. Die nun anstehende Frage, inwieweit die Erfahrungen auf das Verhalten von hES-Zellen übertragbar sind, kann ausschließlich auf dem Weg über humane Zellen selbst geklärt werden. Dies gilt insbesondere deshalb, weil bekanntermaßen die Eigenschaften von murinen und humanen Zellen deutlich variieren.

Es ist wegen der nach derzeitigem wissenschaftlichen Kenntnisstand noch nicht möglichen Isolierung genügender Mengen kardialer Stammzellen, wegen der derzeit noch nicht ausreichend vielversprechenden Erfolgsaussichten, aus Knochenmarkstammzellen bzw. Blutstammzellen definierte kardiale Stammzell-Populationen zu gewinnen sowie unter Berücksichtigung auch bei Nutzung anderer Zellen abzuwägender ethischer Fragen nicht vertretbar, im Antragsverfahren entgegen der Planung des Forschungsvorhabens auf den Einsatz adulter humaner Stammzellen oder fötaler Stammzellen menschlicher Herkunft anstelle der Verwendung humaner embryonaler Stammzellen zu verweisen.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 12.09.2007

Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Gegenstand der genehmigten Arbeiten ist die Entwicklung und Validierung eines In-vitro-Assays zur Testung der Toxizität von Wirkstoffen. Der Assay soll auf kardial differenzierten embryonalen Stammzellen von Affen basieren, kardial differenzierte hES-Zellen dienen in der Phase der Etablierung zur Klärung der Fragestellung, ob und inwiefern sich kardial differenzierte ES-Zellen des Rhesus- bzw. Javaneraffen und des Menschen in dem zu entwickelnden In-vitro-Testsystem identisch verhalten und sich aus den mit Affenzellen gewonnenen Ergebnissen Aussagen treffen lassen, die für die Situation im Menschen relevant sind. Im Rahmen der Forschungsarbeiten sollen die Wirkungen von pharmakologisch wirksamen Substanzen aus unterschiedlichen Substanzklassen mit bekannten kardialen Wirkungen und Nebenwirkungen auf kardial differenzierte Zellen untersucht werden.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die zusätzlich genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung medizinischer Kenntnisse bei der Entwicklung therapeutischer Verfahren zur Anwendung bei Menschen.

Derzeit basiert die Überprüfung von Kardiotoxizität, sofern sie in Zellkultur durchgeführt wird, auf primären Kardiomyozyten verschiedener Spezies, insbesondere der Ratte. Primäre Kardiomyozyten haben jedoch nur eine sehr begrenzte Lebens- und Teilungsfähigkeit und zeigen bereits kurz nach der Etablierung der Kultur Anzeichen von Dedifferenzierung (ca. 48 h).  In den nun genehmigten Forschungsarbeiten soll durch vergleichende Untersuchung der Wirkung bekannter kardial wirksamer Substanzen auf ES-Zell-abgeleitete Kardiomyozyten verschiedener Spezies überprüft werden, ob bzw. in welchem Maße sich aus tierischen ES-Zellen differenzierte Kardiomyozyten (insbesondere jene des Affen) unter dem Einfluss verschiedenster Wirkstoffe mit kardialen (Neben-) Wirkungen so verhalten wie menschliche Kardiomyozyten. Letztlich soll so zur Klärung der Frage beigetragen werden, ob die unter Nutzung tierischer kardialer Zellen gewonnenen Ergebnisse aus Toxizitätstestungen solide Aussagen über ihre Wirkung in menschlichen Herzzellen zulassen. Dies ist relevant, da die kardialen Wirkungen von toxischen Substanzen in verschiedenen Spezies (insbesondere zwischen Nager und Mensch) teils deutlich variieren können.

Im Falle vergleichbarer Substanz-Wirkungen, die insbesondere für die kardial differenzierten Zellen des Affen und des Menschen erwartet werden, sollen die Ergebnisse Grundlage für die Entwicklung eines (auf Affenzellen basierenden) In-vitro-Toxizitätstests sein, wobei hES-Zellen hier zur Etablierung und Validierung des Testsystems verwendet werden sollen. Ein solcher Test könnte perspektivisch zur Erhöhung der Arzneimittelsicherheit beitragen.

Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Protokolle für die kardiale Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus, des Rhesusaffen und des Menschen sind bereits in der Literatur beschrieben, wobei die bisherigen Untersuchungen des Genehmigungsinhabers an murinen und humanen ES-Zellen zur Etablierung und Optimierung solcher Protokolle beigetragen haben. Die experimentellen Techniken, die zur Charakterisierung von kardialen Zellen unter dem Einfluss pharmakologisch wirksamer Substanzen genutzt werden sollen, wurden von ihm an aus mES-Zellen hergestellten murinen Herzzellen etabliert und im Rahmen des oben beschriebenen Projektes bereits zur pharmakologischen Charakterisierung von aus hES-Zellen differenzierten kardialen Zellen genutzt. Der Genehmigungsinhaber hat zu diesem Thema bereits mehrere Publikationen – zwischenzeitlich auch zur kardialen Differenzierung von hES-Zellen sowie zu deren pharmakologischen Charakterisierung – vorgelegt. Die Fragestellungen des Projektes sind daher vorgeklärt.

Im genehmigten Vorhaben werden aus hES-Zellen differenzierte kardiale Zellen zu Vergleichszwecken benötigt. Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass eine Verwendung anderer Zellen als humaner embryonaler Stammzellen zur Erreichung der Forschungsziele aus den bereits unter 5. genannten Gründen auch weiterhin nicht möglich ist.

Genehmigungserweiterung vom 15.12.2011

Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Gegenstand der genehmigten Arbeiten ist die Untersuchung von Rezeptoren im menschlichen Herzen, deren Gene zur Genfamilie der olfaktorischen Rezeptoren gehören und die während der Entwicklung von kardialen Zellen aus hES-Zellen exprimiert werden. Liganden, die an diese Rezeptoren binden, sollen identifiziert und bezüglich ihrer Wirkung auf sich entwickelnde Herzzellen charakterisiert werden. Zelluläre Signalübertragungswege, die infolge der Ligandenbindung in kardialen Zellen aktiviert bzw. gehemmt werden, sollen untersucht und so ein möglicher Einfluss olfaktorischer Rezeptorproteine auf die Entwicklung von Herzzellen bestimmt werden. Schwerpunkt der Arbeiten ist die Analyse des Calcium Signalling in aus hES-Zellen gewonnenen kardialen Zellen unter dem Einfluss von Liganden für olfaktorische Rezeptoren.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die zusätzlich genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung.

Mit den genehmigten Arbeiten an hES-Zellen sollen Erkenntnisse über die mögliche Beteiligung von olfaktorischen Rezeptoren an der Entwicklung von Herzzellen gewonnen werden. Insbesondere sollen die Auswirkungen der Aktivierung olfaktorischer Rezeptoren auf das Calcium Signalling sich entwickelnder kardialer Zellen und – damit in Zusammenhang stehend – auf die Aktivierung (bzw. Hemmung) von Signalwegen in Herzzellen bestimmt werden. Die funktionelle Bedeutung der Aktivierung entsprechender Signalkaskaden für die Entwicklung und Funktion von Herzzellen soll aufgeklärt werden.

Die Hypothese, dass olfaktorische Rezeptoren in kardialen Zellen des Menschen vorkommen, dort möglicherweise eine physiologische Funktion haben und sich die Expression der entsprechenden Gene im Laufe der Differenzierung verändern kann, wird durch experimentelle Befunde belegt, die im Antragsverfahren dargelegt wurden. Zum einen werden Gene für olfaktorische Rezeptoren im Septum und Ventrikel des adulten menschlichen Herzens deutlich stärker exprimiert als in anderen untersuchten Geweben. Eine Aktivierung dieses Rezeptors mittels des spezifischen Liganden führte am isolierten Herzmuskel zu einem negativ inotropen Effekt, was auf eine mögliche physiologische Relevanz des Rezeptors hindeutet. Zum anderen konnte die Expression dieses Rezeptors auch in kardial differenzierten hiPS-Zellen, nicht aber in undifferenzierten hiPS-Zellen, nachgewiesen werden. In kardial differenzierten hiPS-Zellen führte die Applikation des entsprechenden Liganden zur weitgehenden Blockade des Kalzium-Transportes, was auf eine mögliche physiologische Rolle des Rezeptors in der Herzfunktion hinweist. Die nähere Untersuchung der Funktion von olfaktorischen Rezeptoren im menschlichen Herzen könnte somit einen Beitrag zum tieferen Verständnis der molekularen Grundlagen der Herzphysiologie liefern.

Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Protokolle für die kardiale Differenzierung embryonaler Stammzellen des Menschen sind bereits in der Literatur beschrieben worden und wurden vom Genehmigungsinhaber selbst im Rahmen von nach dem StZG genehmigten Forschungsvorhaben etabliert und optimiert. Es wurde ferner dargelegt, dass in kardial differenzierten humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) wenigstens ein Gen für einen olfaktorischen Rezeptor relativ stark exprimiert wird und dass die Aktivierung des Rezeptors zu einer weitgehenden Blockade des Kalzium-Transportes in Herzzellen führt. Dies ist ein Anhaltspunkt dafür, dass die differenzierungsabhängige Expression von Genen für olfaktorische Rezeptoren eine Rolle bei der Entwicklung kardialer Zellen spielen könnte. Ferner wurde dargelegt, dass auch aus verfügbaren micro array-Daten eine Expression von bestimmten Genen für olfaktorische Rezeptoren in sich kardial differenzierenden hES-Zellen ersichtlich ist. Schließlich deuten im Antragsverfahren dargelegte Daten zur Präsenz eines olfaktorischen Rezeptors in adultem menschlichem Herzgewebe sowie der negativ inotrope Effekt der Rezeptoraktivierung auf eine mögliche Rolle dieses Rezeptors bei der Regulation der Herzfunktion hin.

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass die Forschungsziele voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreicht werden können. Zur Notwendigkeit der Nutzung von hES-Zellen für die Gewinnung kardialer Zellen des Menschen wurde auf die in den bisherigen Antragsverfahren dargelegten Gründe verwiesen, die weiterhin gültig sind (siehe 5.). Ferner wurde dargelegt, dass in der Genfamilie der olfaktorischen Rezeptoren speziesübergreifend zahlreiche konservierte Sequenzen existieren, wobei die Ligandenspezifität eines Rezeptors vielfach nur durch wenige hochvariable Aminosäuren bestimmt wird. Für menschliche olfaktorische Rezeptoren existieren in der Maus in vielen Fällen jeweils mehrere (genetische) Homologe, die aber in vielen Fällen andere Liganden als ihre potentiellen homologen Proteine im Menschen binden und bei denen es sich folglich nicht um funktionelle Homologe handelt. Daher müsste zunächst für jeden potentiell (funktionell) homologen Rezeptor in der Maus einzeln untersucht werden, welche Liganden dieser bindet und welche Effekte die Ligandenbindung in kardialen Zellen der Maus haben. Selbst wenn es gelänge, einen olfaktorischen Rezeptor mit identischem Liganden in der Maus zu identifizieren, so könnte aufgrund der Unterschiede in der Herzphysiologie vom Maus und Mensch trotzdem nicht zwingend auf eine identische Rolle in kardialen Zellen des Menschen geschlossen werden. Dies kann nur an humanen Zellen untersucht werden.

Im Antragsverfahren wurde auch dargelegt, dass zur Erreichung der Forschungsziele keine hiPS-Zellen genutzt werden können. Zum einen ist die Frage, ob hES- und hiPS-Zellen ein identisches kardiales Entwicklungspotential haben, derzeit nicht abschließend geklärt. Insbesondere ist angesichts jüngerer Veröffentlichungen offen, obdas für die Projektdurchführung besonders wesentliche Calcium Signalling in aus hES- und iPS-Zellen differenzierten kardialen Zellen ähnlich ausgereift ist oder ob das Calcium Signalling in aus hiPS-Zellen abgeleiteten Zellen demjenigen adulter menschlicher Kardiomyozyten weniger entspricht als jenes von kardialen hES-Zell-Derivaten. Zum anderen ist ein Ziel des Forschungsvorhabens die Klärung der Frage, welche Rolle die Expression bestimmter olfaktorischer Rezeptorgene in sich kardial differenzierenden Zellen während der Kardiogenese des Menschen spielt. Für die Untersuchungen von Prozessen der menschlichen Herzentwicklung und daran beteiligter Moleküle (hier: olfaktorische Rezeptoren und deren Liganden) sind aus hES-Zellen differenzierte Kardiomyozyten aber ein besser geeignetes entwicklungsbiologisches Zellmodell als hiPS-Zellen, weil sie nach derzeitigem Kenntnisstand eine größere natürliche Nähe zum menschlichen Embryo aufweisen als (reprogrammierte) hiPS-Zellen.

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