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Erteilt am 19.12.2002. Genehmigung erweitert am 17.06.2008 (siehe 6.), 08.05.2009 (siehe 2.) und 16.05.2012 (siehe 2.). Registereintrag zuletzt aktualisiert am 16.05.2012.
Professor Dr. Oliver Brüstle (Institut für Rekonstruktive Neurobiologie, Universitätsklinikum Bonn).
Die vorgesehenen Forschungsarbeiten basieren auf humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) der folgenden Linien:
Im Rahmen der Erweiterung der Genehmigung vom 08.05.2009 und 16.05.2012 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen folgender weiterer Linien genehmigt:
Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).
Ziel des genehmigten Projektes ist es, neurale und gliale Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen zu gewinnen und deren Entwicklungs- und Regenerationspotential am Tiermodell zu untersuchen. Mit dem Forschungsvorhaben wird auf die nachfolgend dargestellte Weise folgender wissenschaftlicher Erkenntnisgewinn angestrebt:
Basierend auf den langjährigen Erfahrungen des Genehmigungsinhabers mit murinen embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) sollen zunächst die Bedingungen für die Kultur und effektive Differenzierung von hES-Zellen in Nervenvorläuferzellen etabliert werden. Für die Kultivierung von hES-Zellen sollen im Laufe des Projektes neben konventionellen Methoden auch automatisierte Kultursysteme und trägerbasierte Suspensionskulturen genutzt werden.
Nach Differenzierung von hES-Zellen in neurale (Vorläufer-)Zellen sollen diese angereichert werden. Dazu sollen zum einen für neurale Zellen typische Oberflächenmoleküle genutzt werden. Zum anderen sollen die Zellen unter Nutzung von adeno-, lenti-, und retroviralen Vektoren genetisch markiert und dann mit Hilfe von lineage selection- Methoden angereichert werden. Ferner soll eine effektivere Differenzierung von hES-Zellen in Oligodendrozyten und Neuronen erreicht werden, indem Gene für Transkriptionsfaktoren in die Zellen eingebracht werden, deren Produkte für diese Zelltypen spezifische Genexpressions-Programme aktivieren und somit die oligodendrogliale bzw. neuronale Differenzierungsrichtung anstoßen. Zur besseren Vermehrung von aus hES-Zellen abgeleiteten neuralen Zellen sollen diese auch mit Genen transfiziert werden, deren Produkte die Zellvermehrung stimulieren (wie z.B. dem Gen für Telomerase). Die genetischen Modifikationen sollen zudem so vorgenommen werden, dass sie durch Proteintransfektion der Zellen mit Rekombinasen regulierbar und reversibel sind, womit unerwünschte Effekte der vorgenommenen Veränderungen auf die funktionellen Eigenschaften der Zellen weitgehend verhindert werden sollen.
Nach umfangreicher Charakterisierung, auch unter Nutzung von Genchip-Technologien und unter Bestimmung der Methylierungsmuster der Zellen, sollen die abgeleiteten Vorläuferzellen in Transplantationsexperimenten in Hirnschnitt-Kulturen neonataler und adulter Ratten sowie in vivo untersucht werden. Zu diesem Zweck werden neurale Vorläuferzellen in das Gehirn embryonaler, neonataler und adulter Nager implantiert. Die Untersuchungen am Tiermodell erlauben es, Migration und Differenzierung humaner neuraler Vorläuferzellen im Kontext des sich entwickelnden Gehirns zu erforschen. Diese konkreten Forschungsziele können langfristig für die Etablierung neuer Verfahren zur Behandlung bisher nicht therapierbarer neurodegenerativer Erkrankungen relevant sein.
Bei dem Forschungsvorhaben wird mit einer voraussichtlichen Dauer von ca. 5 Jahren gerechnet.
Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die vorgesehenen Forschungsarbeiten an den hES-Zell-Linien nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:
Die Fragestellungen, die mit der Übertragung der an mES-Zellen erarbeiteten Verfahren und Analysen auf hES-Zellen bzw. auf die aus ihnen differenzierten Nervenvorläuferzellen verfolgt werden, sind innerhalb der Grundlagenforschung von essentieller Bedeutung. Sowohl die geplanten In-vitro-Versuche als auch die In-vivo-Experimente sollten es erlauben, Fragen nach den Faktoren und Bedingungen zu beantworten, die für die Ausbildung und Entwicklung von neuralen Zellen beim Menschen zwingend erforderlich sind. Damit lassen sich auch grundlegende Erkenntnisse im Hinblick auf die Regulation dieser komplexen und bisher noch nicht verstandenen Vorgänge während der Embryonalentwicklung oder sogar im adulten ZNS gewinnen.
Die oben genannten konkreten Forschungsziele können darüber hinaus mittelfristig bzw. längerfristig potentiell relevant sein für die Erweiterung medizinischer Erkenntnisse bei der Entwicklung diagnostischer / präventiver / therapeutischer Verfahren zur Anwendung bei Menschen.
Das heißt hier:
Das Wissen über die Bedingungen für eine effiziente neurale Differenzierung (unter Kulturbedingungen, während der Embryonalentwicklung, im adulten Hirn) ist eine wichtige Voraussetzung für die zukünftige Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung bisher nicht therapierbarer neurodegenerativer Erkrankungen. Hierbei kann es sich sowohl um die Entwicklung sog. Zellersatztherapien unter Einsatz aus humanen embryonalen Stammzellen oder aber auch aus somatischen Stammzellen differenzierter Nervenvorläuferzellen handeln. Insofern ist das geplante Vorhaben potentiell auch für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze von Bedeutung.
Die Wahl des Versuchsansatzes für die Umsetzung des angestrebten Zieles, hier: die Differenzierung von hES-Zellen in funktionsfähige Nervenvorläuferzellen, ist – ungeachtet aller gerade im Stadium der Grundlagenforschung unvermeidbaren Imponderabilien – im Antragsverfahren plausibel dargelegt und in ausführlichen Vorarbeiten an embryonalen Stammzellen der Maus untersucht und belegt. Es ist schlüssig dargelegt worden, dass es dem Genehmigungsinhaber in Voruntersuchungen an mES-Zellen gelungen ist, effektive Verfahren für die angestrebte gezielte Differenzierung embryonaler Stammzellen in Nervenvorläuferzellen (neuronale und gliale Vorläufer) zu etablieren und diese Zellen in großer Menge und Reinheit zu gewinnen sowie ihre Charakteristika und ihr Verhalten in vitro und in vivo (Transplantation ins Tiermodell) zu untersuchen. Diese Arbeiten wurden auch von anderen Forschergruppen bestätigt und reproduziert.
Voruntersuchungen mit mES-Zellen zur Entwicklung der Bedingungen für die neurale Differenzierung dieser Zellen und deren Erprobung im Transplantationsmodell an Nagern sind vom Genehmigungsinhaber selbst langjährig durchgeführt worden und waren die Grundlage für zahlreiche Arbeiten in der einschlägigen Literatur. Dem Genehmigungsinhaber ist es dabei gelungen, Gliazellen in reiner Form zu gewinnen und die Reparatur Myelin-defizienter Areale in einem Transplantationsmodell in Nagern zu zeigen.
Der Einsatz von hES-Zellen ist voraussichtlich für die Erreichung des mit dem Forschungsvorhaben angestrebten Erkenntnisgewinns erforderlich. Die Erprobung an mES-Zellen stößt, nachdem der Untersuchungserfolg mit diesen erbracht wurde, an Grenzen. Die nun anstehende Frage, inwieweit die Erfahrungen mit murinen Zellen auf das Verhalten von hES-Zellen übertragbar sind, kann ausschließlich auf dem Weg über humane Zellen selbst geklärt werden. Dies gilt insbesondere deshalb, weil die Eigenschaften von murinen und humanen neuralen Zellen bekanntermaßen deutlich variieren.
Es ist wegen derzeit nicht ausreichend vielversprechender Erfolgsaussichten sowie auf Grund der unter realistischen Annahmen nicht in ausreichender Qualität und Menge zu gewährleistender Gewinnbarkeit definierter neuraler Stammzellpopulationen und unter Berücksichtigung auch bei Verwendung anderer Zellen abzuwägender ethischer Fragen nicht vertretbar, den Antragsteller entgegen seiner Planung des Forschungsvorhabens auf den Einsatz adulter humaner Stammzellen oder fötaler Stammzellen menschlicher Herkunft anstatt der Verwendung humaner embryonaler Stammzellen zu verweisen.
Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:
Angaben zu den Forschungsarbeiten
Die bislang im Projekt gewonnen Erfahrungen bei der neuralen Differenzierung von hES-Zellen sollen für die Untersuchung der Fragestellung verwendet werden, ob und inwieweit sich aus hES-Zellen abgeleitete neurale Zellen langfristig zur Behandlung der Epilepsie eignen könnten. Dazu sollen hES-Zellen oder aus ihnen abgeleitete neurale Vorläuferzellen genetisch so modifiziert werden, dass sie antiepileptisch wirkende Faktoren produzieren. Ein möglicher therapeutischer Effekt derart veränderter hES-Zell-abgeleiteter neuraler Vorläufer soll durch Transplantation in verschiedene Nagermodelle der Epilepsie untersucht werden, wobei sowohl erwartete anti-epileptische Effekte als auch die weitere Entwicklung der transplantierten Zellen (terminale Differenzierung, Migration, Integration in das Wirtsgewebe) analysiert werden sollen.
Gleichzeitig soll ein molekulares Marker-System entwickelt und getestet werden, mit dessen Hilfe die funktionelle Integration der transplantierten Neuronen in das Nervengewebe des Empfängertiers untersucht werden kann. Dabei soll vor allem analysiert werden, ob und inwieweit synaptische Kontakte zwischen transplantierten Zellen und Neuronen des Wirtes in gesunden bzw. experimentell epileptischen Tieren hergestellt werden. Auf diesem Wege sollen auch spezifische Regionen des Hippocampus identifiziert werden, die sich besonders für die Transplantation der humanen Zellen eignen, d. h. in denen eine hohe Konnektivität des Transplantates sowie eine möglichst weiträumige Ausschüttung antiepileptisch wirkender Faktoren durch die transplantierten Neuronen erreicht werden.
Für die Forschungsarbeiten ist eine Dauer von 5 Jahren vorgesehen.
Hochrangigkeit der Forschungsziele
Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die zusätzlich genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung medizinischer Kenntnisse bei der Entwicklung therapeutischer Verfahren zur Anwendung bei Menschen.
Der Genehmigungsinhaber hat bereits unter Verwendung entsprechend genetisch veränderter muriner ES-Zellen gezeigt, dass die Transplantation von aus diesen differenzierten neuralen Vorläuferzellen in ein Maus-Epilepsie-Modell zu einer deutlichen Verminderung der Tendenz der Tiere führte, nach entsprechender Stimulation generalisierte epileptische Anfälle zu entwickeln. In den nun genehmigten Arbeiten soll in einem proof-of-concept nachgewiesen werden, dass ähnliche wie mit murinen Zellen beobachtete Effekte auch unter Nutzung humaner embryonaler Stammzellen im Tiermodell erzielt werden können. Im Erfolgsfall wäre dies ein wesentlicher Schritt auf dem Wege zur Entwicklung neuer Therapieansätze für die Epilepsie.
Aus dem genehmigten Projekt sind Erkenntnisse darüber zu erwarten, inwieweit und unter welchen Bedingungen sich transplantierte humane neurale Vorläuferzellen funktionell in bestimmte Regionen des Hippocampus der Maus integrieren können. Dazu ist die Verwendung eines retrograden transsynaptischen Markierungssystems vorgesehen, das bereits unter Nutzung von Mauszellen erprobt wurde. Durch alternative Expression dieses Marker-Gens entweder in den transplantierten humanen Zellen oder in den Mausneuronen in unmittelbarer Umgebung des Transplantationsortes können sich Erkenntnisse darüber ergeben, ob und unter welchen Bedingungen die transplantierten Zellen afferente oder efferente synaptische Verbindungen mit Wirtsneuronen bilden. Durch eine zusätzliche Veränderung der experimentellen Bedingungen (z.B. Transplantation in gesunde Tiere und in Mausmodelle der Epilepsie, Transplantation in verschiedene Regionen des Hippocampus) können aus den geplanten Versuchen voraussichtlich neue Daten über Eigenschaften und Entwicklung von neuronalen Vorläuferzellen des Menschen nach ihrer Transplantation in vivo gewonnen werden, insbesondere über ihre Differenzierung, ihre Vitalität und ihre Ankopplung an das Nervensystem des Transplantatempfängers.
Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen
Die genehmigten experimentellen Arbeiten zur Nutzung von genetisch modifizierten hES-Zellen für die Untersuchung möglicher anti-epileptischer Effekte in Modellen für die Epilepsie sind umfangreich unter Nutzung von mES-Zellen und aus ihnen differenzierten neuralen Zellen vorgeklärt worden. Dasselbe gilt für die geplante Nutzung des genannten Markersystems. Zudem wurde im Antragsverfahren dargelegt, dass bereits erhebliche eigene Erfahrungen bei der Herstellung stabiler neuraler Vorläuferzell-Linien in hoher Zahl und Qualität unter Nutzung von hES-Zellen bestehen.
Die Erreichung der formulierten langfristigen Ziele (Schaffung von Grundlagen für neue zellbasierte Therapieansätze zur Behandlung der Epilepsie) erfordert die Nutzung menschlicher Zellen. Ausreichende Mengen humaner neuraler Vorläuferzellen mit reproduzierbaren Eigenschaften und in konstanter Qualität, wie sie für eine erfolgreiche Transplantation in das ZNS erforderlich sind, können nach gegenwärtigem Kenntnisstand nur aus humanen embryonalen Stammzellen hergestellt werden. Vorläuferzellen, beispielsweise aus fötalen menschlichen Gehirnen, sind in Kultur weiterhin nicht ausreichend vermehrbar und müssen, um ein verbessertes Wachstum zu ermöglichen, mit Onkogenen immortalisiert werden. Die Reaktivierung der Expression dieser Onkogene kann selbst im Fall der Nutzung konditionell aktiver Expressionssysteme nicht ausgeschlossen werden. Zudem sind die Effekte einer möglichen Restaktivität der zur Immortalisierung genutzten Onkogene nicht abschätzbar. Da im beantragten Forschungsvorhaben Erkenntnisse über Zelltypen erzielt werden sollen, die für die langfristig in Blick genommenen therapeutischen Anwendungen grundsätzlich geeignet sind und die genannten Nachteile nicht aufweisen, kommen mit Onkogenen immortalisierte Zellen für die Durchführung des Forschungsvorhabens nicht in Betracht.
Auch im Hinblick auf den derzeitigen Kenntnisstand über induzierte pluripotente Zellen (iPS-Zellen) des Menschen ist die Verwendung von hES-Zellen zur Erreichung der Projektziele erforderlich. Es ist beispielsweise derzeit nicht geklärt, ob aus iPS-Zellen ähnlich robuste und potente neurale Vorläuferzellen gewonnen werden können wie aus hES-Zellen. Für Vorläuferzellen aus humanen iPS-Zellen liegen – im Gegensatz zu solchen aus hES-Zellen – bislang keine Publikationen dazu vor, ob Tumorentstehung nach Transplantation in das ZNS von Versuchstieren durch effiziente Anreicherungs- und Differenzierungsschritte im Vorfeld der Transplantation verhindert werden kann. Dies wäre aber angesichts des gegenüber hES-Zellen erhöhten onkogenen Potentials dieser Zellen, das zum einen durch Nutzung von Onkogenen für die Induktion des pluripotenten Zustandes und zum anderen durch das Risiko der Insertionsmutagenese in Folge der Verwendung retro- bzw. lentiviraler Vektoren bei der Herstellung dieser Zellen bedingt sein könnte, eine Voraussetzung, um den Genehmigungsinhaber auf diese Zellen zu verweisen.
Stand: 16.05.2012
