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Forschung zum 3R-Prinzip (Replace, Reduce, Refine)

Seit 2013 ist in der Tierschutz-Versuchstierverordnung die konsequente Umsetzung des 3R-Prinzps zur Vermeidung (Replacement), Verminderung (Reduction) und Verbesserung (Refinement) der Verwendung von Versuchstieren vorgeschrieben. Alternativmethoden können bereits eine Vielzahl an Tierversuchen vollständig ersetzen oder tragen dazu bei, die Anzahl der für Tierversuche benötigten Tiere zu verringern. Für bestimmte Fragestellungen sind jedoch auch weiterhin keine Alternativen verfügbar, beispielsweise bei der Untersuchung des Zusammenspiels verschiedener Organfunktionen im Laufe einer Infektion.

Auch um dem 3R-Prinzip Rechnung zu tragen, werden am RKI verschiedene Alternativmethoden entwickelt und angewandt:
Ein 3R-Schwerpunkt liegt in der Erforschung von Botulinum Neurotoxinen (BoNT). Einem Team des RKI ist es gelungen, ein in vitro-Verfahren zum funktionellen Nachweis klinisch relevanter BoNTs zu entwickeln [1,2]. Die Methode wurde 2019 im Fachmagazin Scientific Reports publiziert und 2021 mit dem 3. Hamburger Forschungspreis für Alternativen zum Tierversuch ausgezeichnet.

Alternativ- und Ergänzungsverfahren werden zudem auch in der Prionenforschung entwickelt und eingesetzt. Hier dienen humane Gehirn-Organoid-Assays in Kombination mit zellfreien Assays wie der Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA, biochemische Technik zur Vervielfältigung fehlgefalteter aggregierter Prionproteine) oder der Real-Time Quaking Induced Conversion (RT-QuIC, hochempfindlicher Test zum Nachweis der Fehlfaltungs- und Aggregationsaktivität krankheitsassoziierter Proteine z.B. von Prionkrankheiten oder der Parkinson-Krankheit) dem Ersatz oder der Reduktion von Tierversuchen zur Quantifizierung von Prion-assoziierter Seeding-Aktivität und Infektiosität [3-5].

Auch in der Erforschung respiratorischer Viren finden Explantat-basierte Kulturen Anwendung. Hier dienen kultivierte Organproben des oberen und unteren Respirationstraktes der Forschung an Influenzaviren, Coronaviren und weiteren, neu auftretenden Viren, sowie der Entwicklung von neuartigen Virostatika [6-12]. Für die Charakterisierung der Antigeneigenschaften von Grippeviren wurden darüber hinaus eine vollsynthetische Typisierungsplattform in Zusammenarbeit mit der Universität Potsdam und dem Fraunhofer Institut IZI-BB entwickelt, die nicht auf Tierprodukte angewiesen ist. Dieses Projekt („FluType“) wurde im Jahr 2017 mit dem Berliner Landespreis für Alternativmethoden für Tierversuche in Forschung und Lehre ausgezeichnet.

Zur Untersuchung von Erreger-Wirts-Interaktionen bei Darmparasiten des Menschen sind, vor allem hinsichtlich Feldisolaten oder neuartigen Erregern, derzeit keine geeigneten Zellkultursysteme verfügbar. Ein RKI-Team entwickelt daher Darm-Organoide zur Untersuchung dieser intestinalen Infektionskrankheiten [13,14]. Zudem wurde eine Biobank mit Geweben des Menschen und verschiedener Tierspezies (z.B. Schwein, Wildnager, Huhn) etabliert, die zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen genutzt werden.

Da Tierversuche auch im Hinblick auf die artspezifische Fähigkeit der Tiere, unter den Versuchseinwirkungen zu leiden, auf das unerlässliche Maß zu beschränken sind (§ 7 Abs. 1, 1c TierSchG), werden am RKI für bestimmte Fragestellungen Larven von Wachsmotten (Galleria melonella) anstelle von Wirbeltieren verwendet [15].

Das Fachgebiet MF3 Tierexperimentelle Forschung und 3R ist über eine Kooperation mit dem Institut für Tierschutz, Tierverhalten und Versuchstierkunde der Freien Universität Berlin an der Auswertung des Bf3R-geförderten Projektes "SimulRATor" beteiligt, das der systematischen Evaluierung von Simulatoren der Ratte und der Maus als Alternativ- und Ergänzungsmethode zum Tierversuch in Ausbildung und Lehre dient [16]. Ein weiteres Kooperationsprojekt zielt auf die Etablierung einer 3D-Zellkultur des Endometriums der Maus mit dem Ziel des Replacements bspw. bei toxikologischen Fragestellungen ab.

In der Tierhaltung wird nicht nur auf die Implementierung, sondern auch auf die Erforschung von Refinementmaßnahmen geachtet. Hier wurde bspw. der Frage nachgegangen, wie die Zucht- und Haltungsbedingungen sowie das Handling von Rötelmäusen verbessert werden kann, um einerseits das Wohlbefinden der Tiere zu verbessen und andererseits eine für die Tiere stressfreiere Umgangsweise bei Eingriffen wie bspw. beim Wiegen zu ermöglichen [5].

Darüber hinaus ist das RKI beim Einstein-Zentrum 3R vertreten, einer Kooperation verschiedener Berliner Forschungseinrichtungen mit dem Ziel, vornehmlich mit Hilfe von Organoiden Ersatzmethoden für Tierversuche zu etablieren.

Das 3R-Prinzip in der Ausbildung und Lehre

Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler des RKI beteiligen sich mit ihrer 3R-Expertise an einer institutsübergreifenden Aus-, Fort- und Weiterbildungsveranstaltung im Rahmen der mit dem Preis des Landes Berlin für Alternativmethoden in der Lehre und Ausbildung prämierten Seminarreihe "Alternatives to animal use in research and education - Refine, Reduce & Replace". Diese bietet Studierenden und Forschenden einen Überblick über ethische und rechtliche Aspekte von Tierversuchen und Alternativmethoden, sowie über die Anforderungen an die Entwicklung und Zulassung von Alternativverfahren

In der Ausbildung von tierexperimentell tätigen Mitarbeitenden des RKI werden zudem neben Eigenkreationen auch kommerziell erhältliche Kunststoff-Modelle von Ratten oder Kaninchenohren eingesetzt, die durch ein verbessertes Training der Mitarbeitenden vor der Übung am Tier dem Refinement Rechung tragen.

Ausgewählte Publikationen

[1] Stern D, von Berg L, Dorner MB, Dorner BG (2018):
Replacing the mouse bioassay for diagnostics and potency testing of botulinum neurotoxins – progress and challenges.
Berl Münch Tierärztl Wochenschrift, DOI: 10.2376/0005-9366-17110

[2] von Berg L, Stern D, Pauly D, Mahrhold S, Weisemann J, Jentsch L, Hansbauer EM, Müller C, Avondet MA, Rummel A, Dorner MB, Dorner BG (2019):
Functional detection of botulinum neurotoxin serotypes A to F by monoclonal neoepitope-specific antibodies and suspension array technology.
Sci Rep. 2019 Apr 2;9(1):5531. doi: 10.1038/s41598-019-41722-z

[3] Boerner S, Wagenführ K, Daus ML, Thomzig A, Beekes M (2013):
Towards further reduction and replacement of animal bioassays in prion research by cell and protein misfolding cyclic amplification assays.
Lab Anim. 2013 Apr;47(2):106-15.doi: 10.1177/0023677213476856

[4] Beekes M, Wagenführ K (2013):
Alternatives to animal bioassays for prions.
Altern Lab Anim. 2013 Dec;41(6):P72-6. doi: 10.1177/026119291304100625

[5] Paul L, Kirsch P, Thomzig A, Thöne-Reineke C, Beekes M (2018):
Practical approaches for refinement and reduction of animal experiments with bank voles in prion research.
Berl Münch Tierärztl Wochenschrift, DOI: 10.2376/0005-9366-17108

[6] Lauster D, Klenk S, Ludwig K, Nojoumi S, Behren S, Adam L, Stadtmüller M, Saenger S, Zimmler S, Hönzke K, Yao L, Hoffmann U, Bardua, M, Hamann A, Witzenrath M, Sander L, Wolff T, Hocke AC, Hippenstiel S, De Carlo S, Neudecker J, Osterrieder K Budisa N, Netz RR, Böttcher C, Liese S, Herrmann A, Hackenberger CPR (2020):
Phage capsid nanoparticles with defined ligand arrangement block influenza virus entry.
Nat Nanotechnol. 2020 May;15(5):373-379. doi: 10.1038/s41565-020-0660-2

[7] Grund C, Hoffmann D, Ulrich R, Naguib M, Schinköthe J, Hoffmann B, Harder T, Saenger S, Zscheppang K, Tönnies M, Hippenstiel S, Hocke A, Wolff T, Beer M (2018):
A novel European H5N8 influenza A virus has increased virulence in ducks but low zoonotic potential.
Emerg Microbes Infect. 2018 Jul 19;7(1):132. doi: 10.1038/s41426-018-0130-1

[8] Pohl MO, von Recum-Knepper J, Rodriguez-Frandsen A, Lanz C, Wolff T, Chanda SK, Stertz S (2017):
Identification of Polo-like kinases as potential novel drug targets for influenza A virus.
Sci Rep. 2017 Aug 17;7(1):8629. doi: 10.1038/s41598-017-08942-7

[9] Hocke AC, Becher A, Knepper J, Peter A, Holland G, Tönnies M, Bauer TT, Schneider P, Neudecker J, Muth D, Wendtner CM, Rückert JC, Drosten C, Gruber AD, Laue M, Suttorp N, Hippenstiel S, Wolff T (2013):
Emerging human Middle East Respiratory Syndrome (MERS) coronavirus causes widespread infection and alveolar damage in human lung.
Am J Respir Crit Care Med. 2013 Oct 1;188(7):882-6. doi: 10.1164/rccm.201305-0954LE

[10] Knepper J, Schierhorn KL, Becher A, Budt M, Tönnies M, Bauer TT, Schneider P, Neudecker J, Rückert JC, Gruber AD, Suttorp N, Schweiger B, Hippenstiel S, Hocke AC, Wolff T (2013):
The novel human influenza A(H7N9) virus is naturally adapted to efficient growth in human lung tissue.
mBio. 2013 Oct 8;4(5):e00601-13. doi: 10.1128/mBio.00601-13

[11] Hocke AC, Berg J, Becher A, Knepper J, Klauschen F, Tönnies M, Bauer TT, Schneider P, Neudecker J, Rückert JC, Gruber AD, Suttorp N, Hippenstiel S, Wolff T (2013):
Type II pneumocyte infection by influenza A virus in human pulmonary fibrosis.
J. Infect. Dis. 207(4):693-5. doi: 10.1093/infdis/jis740

[12] Weinheimer VK, Becher A, Tönnies M, Holland G, Knepper J, Bauer TT, Schneider P, Neudecker J, Rückert JC, Szymanski K, Temmesfeld-Wollbrueck B, Gruber AD, Bannert N, Suttorp N, Hippenstiel S, Wolff T*, Hocke AC (2012):
Influenza A viruses target type II pneumocytes in the human lung.
J Infect Dis. 2012 Dec 1;206(11):1685-94. doi: 10.1093/infdis/jis455
*corresponding author

[13] Thammasit P, Tharinjaroen CS, Tragoolpua Y, Rickerts V, Georgieva R, Bäumler H, Tragoolpua K (2021):
Targeted propolis-loaded poly (butyl) cyanoacrylate nanoparticles: An alternative drug delivery tool for the treatment of cryptococcal meningitis.
Front. Pharmacol. 2021 (accepted)

[14] Holthaus D, Delgado-Betancourt E, Aebischer T, Seeber F, Klotz C (2021):
Harmonization of Protocols for Multi-Species Organoid Platforms to Study the Intestinal Biology of Toxoplasma gondii and Other Protozoan Infections.
Front Cell Infect Microbiol. 2021 Feb 22;10:610368. doi: 10.3389/fcimb.2020.610368. eCollection 2020.

[15] Kirubakar G, Schäfer H, Rickerts V, Schwarz C, Lewin A (2020):
Mutation on lysX from Mycobacterium avium hominissuis impacts the host-pathogen interaction and virulence phenotype.
Virulence. 2020 Dec;11(1):132-144. doi: 10.1080/21505594.2020.1713690

[15] Humpenöder M, Corte GM, Pfützner M, Wiegard M, Merle R, Hohlbaum K, Erickson NA et al. (2021):
Alternatives in education – rat and mouse simulators evaluated from course trainers' and supervisors' perspective.
Animals (Basel) 11 (7): 1848. Epub Jun 22. doi: 10.3390/ani11071848

Stand: 17.08.2021

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