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Empfehlungen zu Nachuntersuchungsproben von therapeutischen Blutkomponenten und Rückstellproben von Plasmapools

V 17 (09.1997)

Votum des AK Blut

Bei der 24. Sitzung des Arbeitskreises Blut am 3.September 1997 wurde folgendes Votum (V 17) verabschiedet:


In den folgenden Empfehlungen werden Voraussetzungen und wichtige Gesichtspunkte zusammengestellt, die zu beachten sind, wenn Nachuntersuchungsproben von therapeutischen Blutkomponenten oder Rückstellproben von Plasmapools für Rückverfolgungsverfahren entnommen und gelagert werden.


1. Grundlage und Begriffsbestimmungen

1.1. Grundlage

Grundlage für die weiteren Ausführungen sind die Betriebsverordnung für pharmazeutische Unternehmer (PharmBetrV.), der Leitfaden einer Guten Herstellungspraxis für pharmazeutische Produkte (PIC-GMP-Leitfaden), Richtlinie der Kommission zur Festlegung der Grundsätze und Leitlinien der Guten Herstellungspraxis für zur Anwendung beim Menschen bestimmter Arzneimittel (EG-GMP-Richtlinie - Humanarzneimittel) und die Richtlinien zur Blutgruppenbestimmung und Bluttransfusion (Hämotherapie) (aufgestellt von Wissenschaftlichen Beirat der Bundesärztekammer und vom Paul-Ehrlich-Institut) in der jeweils geltenden Fassung.

1.2. Begriffsbestimmungen

Nachuntersuchungsproben von therapeutischen Blutkomponenten sind einzelne Serum- oder Plasmaproben von der Ausgangsspende.

Als Rückstellproben für Plasmapools sind Plasmaproben aus den ersten zur Herstellung von Plasmaderivaten bereitgestellten Plasmapools zu verstehen.

1.3. Zweck

Nachuntersuchungsproben von therapeutischen Blutkomponenten und Rückstellproben von Plasmapools werden aufbewahrt, um die Nachtestung auf Infektionsmarker über serologische Tests oder Nukleinsäure-Nachweistechniken (NNT) im Rahmen von Look back-Verfahren zu ermöglichen und nachvollziehbar zu dokumentieren.

2. Nachuntersuchungsproben von therapeutischen Blutkomponenten
2.1. Für Rückverfolgungsverfahren sind die Hersteller von therapeutischen Blutkomponenten zur

Aufbewahrung von Serum- oder Plasmaproben für die Nachuntersuchung der Spender auf Infektionsmarker verpflichtet. Die Nachtestung von Anteilen der Nachuntersuchungsprobe sollte nur erfolgen, wenn dies aus Sicherheitsgründen erforderlich ist.

Auch bei Einführung von Nukleinsäure-Nachweistechniken (NNT) kann auf Nachuntersuchungsproben nicht verzichtet werden, da mit der NNT nur auf bestimmte, bekannte Erreger (z.B. HIV, HCV oder HBV) untersucht wird.

2.2. Serum- oder Plasmaproben sind in ausreichenden Mengen für die Nachuntersuchungsprobe aufzubewahren. Es wird ein Volumen von etwa 1 bis 2 ml Serum/Plasma empfohlen. Es sollten Vorkehrungen getroffen werden, die eine Kontamination und unnötiges Auftauen der Nachuntersuchungsprobe verhindert, z.B. zwei Aliquots.

2.3. Nachuntersuchungsproben sollen innerhalb kürzester Zeit abgetrennt und tiefgefroren werden. Es wird empfohlen, Nachuntersuchungsproben innerhalb von 24 Stunden abzutrennen, schnellstmöglich auf -30° oder darunter tiefzufrieren und bei -30°C oder darunter aufzubewahren.

2.4. Die Behältnisse und Bedingungen zur Asservierung von Nachuntersuchungsproben müssen so gewählt werden, daß eine eindeutige Zuordnung des Spenders zur Nachuntersuchungsprobe gegeben ist und die Gefahr einer Kontamination mit anderen Proben weitestgehend ausgeschlossen wird. Als Aufbewahrungsbehältnisse können einzeln verschließbare Mikrotiterplatten oder Einzelröhrchen verwendet werden.

2.5. Nachuntersuchungsproben von therapeutischen Blutkomponenten sind 1 Jahr über die Laufzeit der Präparate hinaus aufzubewahren, d.h. maximal 3 Jahre unter Berücksichtigung einer 24 monatigen Laufzeit von gefrorenem Frischplasma.

2.6. Der pharmazeutische Unternehmer muß gewährleisten, daß die Nachuntersuchungsproben vor dem Zugriff unbefugter Personen geschützt werden. Die Zugangsberechtigung zu den Nachuntersuchungsproben und die Vorgehensweise bei Nachuntersuchungen im Rahmen von Rückverfolgungsverfahren soll durch eine schriftliche Dienstanweisung (SOP) klar geregelt sein.

3. Rückstellproben von Plasmapools

Die erforderliche Menge für Rückstellproben von Plasmapools wird im PIC-GMP-Leitfaden als die Menge definiert, die genügend groß ist, um mindestens eine vollständige Nachprüfung durchführen zu können. Diese Nachprüfung schließt die Durchführung von NNT mit ein, die ggf. zur Erhöhung der Sensitivität des Genom-Nachweises einer Virusanreicherung aus einer größeren Probenmenge bedarf. Unter Berücksichtigung dieser Anforderung ist die Rückstellprobe als Muster von Ausgangsstoffen entsprechend den derzeit rechtsverbindlichen Vorschriften gemäß § 8 (3a) PharmaBetrV mindestens 2 Jahre nach Freigabe des unter Verwendung dieser Ausgangsstoffe hergestellten Arzneimittels bei -30°C oder darunter aufzubewahren.

Nukleinsäure-Nachweistechniken in der Transfusionsmedizin: Voraussetzungen

1. Prinzip der Methode

Nukleinsäure-Nachweistechniken (NNT) können RNA und DNA von Infektionserregern, aber auch von menschlichen Genen nachweisen. Zur Zeit sind fünf kommerziell erhältliche Methoden auf dem Markt: PCR, LCR, NASBA, TMA und b-DNA-assay. Neue Verfahren, die auch das Risiko von Kontaminationen minimieren, sind in Entwicklung.

2. Infektionserreger und ihre Nachweisbarkeit

Nach Eintritt in den Körper erfolgt bei einem dem Immunsystem unbekannten Erreger zunächst eine Phase der Vermehrung, die gewöhnlich zu einer Immunantwort führt. Je nach Infektionserreger ist normalerweise die Immunantwort über Entzündungszeichen und schliesslich über spezifische Antikörper meist innerhalb von 2 Wochen, bei manchen Erregern erst nach 12 bis 16 Wochen nachweisbar.


Häufig verursachen Infektionserreger in der Anfangsphase der Infektion klinische Zeichen, die einen Ausschluss von der Blutspende ermöglichen. Für die NNT besonders relevant sind Infektionserreger wie HBV und HCV, die eine langanhaltende virämische Phase bei geringer klinischer Symptomatik haben können und bei denen der serologische Nachweis verzögert ist. Bei der HCV Infektion kann im Einzelfall mit den derzeitigen Antikörpertests der serologische Nachweis der Infektion nicht gelingen. In der diagnostischen Fensterperiode ist also der Erreger über die serologischen Tests nicht nachweisbar, obwohl Infektiosität bestehen kann. NNT können in dieser Periode positiv ausfallen.

Neben transfusionsrelevanten Viren können auch andere Infektionserreger, wie Bakterien oder Protozoen über NNT nachgewiesen werden.

3. Ausgangsmaterial

Im Blutspendedienst können routinemässig Vollblut, Plasma, Serum und bei Bedarf Zellen für die Diagnostik der Infektionserreger als Ausgangsmaterial herangezogen werden. Zur Zeit sind in Deutschland vor allem folgende Viren transfusionsrelevant: HBV, HCV und HIV. Das Risiko ihrer Übertragung kann durch Einführen der NNT vermindert werden. Wegen geringer Virusmengen und wegen verschiedener Genotypen bzw. Varianten lässt sich eine 100%ige Sicherheit zur Vermeidung transfusionsassoziierter Infektionen auch nach Einführen der NNT nicht erreichen.

HBV - Hepatitis B Virus

In der Frühphase der HBV Infektion können Virusmengen von über 106 Genomequivalenten/ml vorkommen. Der HBs-Antigentest kann ab 104Partikel/ ml positiv werden. HBs-Antigen von HBV Mutanten kann eine geringere Nachweissensitivität verursachen. Mit einsetzender Anti-HBs Produktion fällt die Virusmenge ab. Der Nachweis der HBV-DNA über NNT erfolgt in Plasma oder Serum.

HCV - Hepatitis C Virus

In der Frühphase der HCV Infektion können Virusmengen von bis zu 108 Genomequivalenten/ml vorkommen. Abhängig von der Replikationsrate in der Leber und von der individuellen Immunantwort schwankt die Virusmenge erheblich über die Zeit. Der Nachweis der viralen RNA über NNT ist bei vielen Infizierten auch nach erfolgter Antikörperproduktion in Plasma bzw. Serum möglich. Typisch für die HCV Infektion ist eine undulierende Virusmenge.

HIV - Humanes Immunschwächevirus

In der Frühphase der HIV Infektion können Virusmengen von bis zu 108 Genomequivalenten/ml vorkommen. Der Virusnachweis über die NNT ist während der Zeit der Antikörperbildung möglich. Die Virusmenge in Serum bzw. Plasma unterliegt Schwankungen. Der HIV-Nachweis ist auch über provirale DNA in T-Lymphozyten möglich. HIV-2 und HIV-1 Subtyp O werden über die NNT derzeit mit kommerziell erhältlichen Tests nicht erfasst.

4. Analytische Sensitivität

HCV und HIV sind RNA-haltige Viren, HBV ist ein DNA-haltiges Virus. Bei der Extraktion von Nukleinsäuren und dem Umschreiben von RNA in DNA können je nach Verfahren, Primer-Auswahl und Heterogenität der Primer-Bindungsstellen erhebliche Verluste (über 80%) auftreten und somit die Sensitivität beeinflussen. Im Virus eingehüllte DNA/RNA ist bei 4°C für Tage, bei -20°C für Wochen und bei tieferen Temperaturen für Monate bis Jahre haltbar. Nach Zerstören der Virushülle wird freie RNA von HCV und HIV im Plasma/Serum schnell, d.h. innerhalb von wenigen Minuten abgebaut. Freigelegte virale DNA von HBV kann für einige Stunden stabil sein. Je länger Vollblut gelagert ist, umso weniger ist es als Ausgangsmaterial für die Durchführung der NNT geeignet.


Die humane infektiöse Dosis ist als absolute Zahl der Viruspartikel schwer bestimmbar. Offenbar können bei HCV und HBV etwa 10 - 100 Partikel und bei HIV etwa 100 Viruspartikel zur Infektion führen. Ob eine Infektion durch Einbringen der Viren direkt in die Blutbahn mit geringerer Virusdosis möglich ist als z.B. beim Sexualverkehr ist ungewiss. Zum Vermeiden einer Infektionsübertragung sollten möglichst wenige Genomequivalente oder Kopien von viralem Erbmaterial im Ausgangsmaterial als untere Nachweisgrenze für die NNT angestrebt werden.

5. Vereinen von Ausgangsmaterial von mehreren Spenden

Wie bei jedem Test und Testverfahren, welches zu einer hohen Sicherheit führen soll, ist bei NNT grundsätzlich eine Testdurchführung in der Einzelspende anzustreben. Das Testen in der Einzelspende hat sich bei den serologischen Nachweismethoden über Jahre bewährt. Aus technischen und finanziellen Gründen sind die Voraussetzungen für das Durchführen der NNT in der Einzelspende derzeit im Blutspendedienst nicht gegeben. Vereinen von Aliquots von verschiedenen Spenden für die Durchführung der NNT im Blutspendewesen ist nur als eine Übergangsregelung zu sehen. Während der Zeit des Übergangs ist ein Vermischen von Einzelvolumina (Pool-Herstellung) und nachfolgende Konzentration der Partikel oder Nukleinsäuren möglich. Verfahren sind z.B.: Ultrazentrifugation, oder Freisetzen der Nukleinsäure, z.B. über chaotrope Substanzen wie Guanidinisothiocyanat, und nachfolgende Adsorption an eine Säulenmatrix und Elution, oder Freisetzen der Nukleinsäure und ihre nachfolgende Präzipitation. Möglich ist auch die aufeinanderfolgende Nukleinsäureadsorption von verschiedenen Spenden an einer Matrix, ohne dass es vorher zu einem Vermischen der Spenden gekommen ist.

Wird ein Zentrifugationsverfahren verwendet, muss gewährleistet sein, dass von den Viren ein ausreichender Anteil wiedergefunden wird. Die Möglichkeit des Abschwimmens der Viren in andere Schichten oder der Adsorption an Röhrchenmaterial muss im Verfahren berücksichtigt werden. Die viralen Nukleinsäuren müssen möglichst quantitativ aus dem Ausgangsmaterial extrahiert werden.

Das notwendige Aliquotvolumen der Einzelspende wird von der Effizienz der Anreicherung der Nukleinsäure und der Sensitivität des NNT bestimmt. Werden Proben vermischt, so ist jeweils ein Pool aus einer möglichst niedrigen Anzahl von Einzelspenden anzustreben.

6. Nukleinsäurefreisetzung und -anreicherung

Das Freisetzen und die Extraktion von Nukleinsäuren ist mit verschiedenen Techniken möglich. Es muss ein technisches Verfahren verwendet werden, welches gewährleistet, dass die freie Nukleinsäure nicht von DNasen oder RNasen abgebaut wird bzw. nicht an die umgebende Matrix adsorbiert wird. Die Effizienz des Freisetzungs- und Extraktionsvorgangs ist durch geeignete Kontrollen, wie Zugabe von Kontrollvirus und Mitführen standardisierter Nukleinsäure-Präparationen regelmässig zu überprüfen. Das verwendete Präparationsverfahren muss gewährleisten, dass die erhaltene Nukleinsäure in einem umschreibbaren, hybridisierbaren und/oder amplifizierbaren Zustand ist.

Wird von Zellmaterial ausgegangen, dann ist zu gewährleisten, dass die virale Nukleinsäure auch noch in einem sehr grossen Überschuss von humaner Nukleinsäure nachgewiesen wird. Eine Inhibition der Nukleinsäurehybridisierung bzw -amplifikation soll durch geeignete Kontrollen erkannt werden.

7. Validierung des NNT Verfahrens

Die Validierung des Verfahrens ist besonders sorgfältig und regelmässig zu überprüfen, auch wenn kommerziell verfügbare NNT verwendet werden: validiert müssen sein z.B. die Anreicherung von HBV, HCV und HIV über physikalische und chemische Verfahren, die Freisetzung, Extraktion und Stabilität der Nukleinsäuren. Verwendete Primer, Sonden und Enzyme müssen auf ihre Bindungsspezifität und Aktivität im jeweiligen Verfahren evaluiert sein.

Liegt der Verdacht auf Koamplifikation von nicht-virusspezifischem genetischem Material vor, dann muss die erhaltene Nukleinsäure über Sequenzierung auf ihre Authentität untersucht werden. Die Möglichkeit einer Kontamination ist durch die Ergebnisse der Kontrollen und im Bedarfsfall Wiederholung des Tests zu überprüfen.

Die Validierung muss die Heterogenität der untersuchten Viren berücksichtigen, z.B. die verschiedenen Genotypen von HBV und HCV, und die verschiedenen Subtypen von HIV sowie deren Prävalenz.

Richtlinien zu Validierung der NNT sind zu entwickeln.

8. Kontrollen

Wie bei jedem Testverfahren ist das Mitführen von Negativ- und Positivkontrollen obligatorisch, zusätzlich sind Inhibitionskontrollen erforderlich. Jeder Verfahrensschritt muss zusätzlich über geeignete Kontrollen periodisch überprüft werden. Die Menge der Nukleinsäure in der Positivkontrolle sollte im unteren Nachweisbereich liegen.

Neben der internen Qualitätskontrolle ist die externe Qualitätskontrolle durch Teilnahme an Ringversuchen unbedingt erforderlich. Stehen für die speziellen Anforderungen im Blutspendewesen geeignete externe Kontrollen nicht zur Verfügung, ist wenigstens jährlich ein Ringversuch mit Hilfe von Experten durchzuführen. Die Proben der Ringversuche müssen Genom der getesten Viren in unterschiedlichen Konzentrationen enthalten und dem Routineverfahren des Blutspendedienstes unterworfen werden. Die Ringversuchsproben sollten dem jeweiligen Genotypen- / Subtypen-Spektrum der Erreger epidemiologisch angepasst sein, auch wenn anzustreben ist, dass alle bekannten Genotypen/ Subtypen über die NNT erfasst werden.

9. Räumliche Voraussetzungen

Voraussetzungen für die Anforderungen zur Durchführung der PCR sind in DIN 58967-60 und 58967-61 niedergelegt und gelten für andere NNT entsprechend. Werden Verfahren verwendet, die einen vollständigen Abbau der Amplifikate vor den Neuansatz eines weiteren Tests garantieren, dann können die DIN Forderungen für die räumlichen Voraussetzungen eingeschränkt werden.

Bei den Hilfsmaterialien, wie Pipetten, Spitzen, Puffervolumina und deren Lagerung, Schutzkleidung etc. sind die in DIN beschriebenen besonderen Voraussetzungen zu erfüllen. Die Belüftung und Entlüftung der Räume soll Kontaminationen durch Amplifikate und Nukleinsäuren vermeiden. Nachdem bei den NNT nur Genomfragmente von Viren vervielfältigt und nachgewiesen werden und somit kein infektiöses Material entsteht, unterliegen die Verfahren der NNT nicht § 19 f des Bundesseuchengesetzes.

Es ist damit zu rechnen, dass in wenigen Jahren Vollautomaten zum Durchführen der NNT erhältlich sind und die derzeit zu fordernden speziellen räumlichen Vorgaben an die NNT teilweise überflüssig machen. Für den Aufwand an Räumlichkeiten sind die unter Punkt 11 aufgeführten Voraussetzungen zur Aufbewahrung von Proben für die eventuelle Nachtestung ebenfalls zu berücksichtigen.

10. Kosten- Nutzen-Aspekte

Dieser Absatz 10 ist noch nicht verabschiedet; der Entwurf wird derzeit überarbeitet

Die Nutzen -Analyse ist abhängig von der Pathogenität eines Virus und von der generellen Bewertung einer viralen Infektionskrankheit durch Medizin und Gesellschaft, die auf sozialem Gebiet für HIV schwerer wiegt als für HCV und HBV. Die Chance auf Heilen einer Krankheit Der Nutzen-Aspekt ist abhängig von der Pathogenität eines Virus und von der generellen durch Therapie, wie z.B. derzeit beim HIV, wird den Stellenwert einer Krankheit je nach Effektivität der Therapeutika verändern.Der Nutzen-Aspekt ist ferner abhängig vom Wert des menschlichen Lebens und des durch Krankheit, Leiden und frühen Tod beeinträchtigten Lebens. HBV und HCV Infektionen können ähnlich wie HIV zu chronischem Siechtum führen und sind folglich entsprechend der HIV Infektion zu bewerten.

Der ethische Wert von Leben und Lebensqualität ist aus ärztlicher Sicht in Geld nicht zu fassen und somit hat der Beitrag zum Verhindern einer Infektionsübertragung Priorität.

Der Kosten-Aspekt hat von der angestrebten Durchführung der NNT in der Einzelspende auszugehen. Ferner ist mit hoher Wahrscheinlichkeit anzunehmen, dass der Preis pro NNT-Test in den kommenden Jahren fallen wird. Die 3 transfusionsrelevanten Viren fallen in der Bewertung des Kosten-Aspekts folgendermassen aus:
Die Kalkulation wird geht aus von 5 Millionen transfundierten Einheiten jährlich, von denen je Patient 3 Einheiten gegeben werden. Für HBV wird eine Übertragungswahrscheinlichkeit von 1: 50.000, für HCV von 1:30.000 und für HIV von 1:1.000.000 angenommen.

Folglich werden auftreten:
für HBV: 33 Infektionen,
für HCV: 55 Infektionen und für HIV 2 Infektionen

Kosten bei einem Preis pro NNT von 2 DM:

15 Millionen Tests ergeben 30 Millionen DM gesamt,
d.h. 303.000 DM pro verhinderter HBV Infektion,
180.000 pro verhinderter HBV Infektion und 5.000.000 pro verhinderter HIV Infektion.

Kosten bei einem Preis pro NNT von 100 DM

15 Millionen Tests ergeben 1500 Millionen DM gesamt,
d.h. 15 Millionen pro verhinderter HBV Infektion,
9 Millionen pro verhinderter HCV Infektion und 750 Millionen pro verhinderter HIV Infektion.

Es besteht derzeit eine Priorität der Infektionsverhinderung für HCV, auch da diese Infektion in etwa 60% im Vergleich zu HBV mit 10% chronisch verläuft. Das Verhältnis von Kosten und Nutzen für das Verhindern einer Infektionskrankheit und ihrer Folgekosten sollte mit dem Aufwand für andere infektionsverhütende und lebensrettende Massnahmen in der Medizin verglichen werden. Bei der Analyse des Aufwandes zum Verhindern eine transfusionsassoziierten Infektion sind die Behandlungskosten der ohne NNT-Testung verursachten chronischen Infektionen abzuziehen, das sind jährlich etwa 700 Millionen DM.

11. Proben für die Nachtestung

Von jeder Spende müssen geeignete Volumina, die eine Nachtestung über NNT und Antikörper ermöglichen, aufbewahrt werden. Plasma/Serum sollte innerhalb von 24 Stunden von den zellulären Bestandteilen abgetrennt sein. Es wird ein Volumen von 1 bis 2 ml Serum/Plasma empfohlen. Es sollen Vorkehrungen getroffen werden, die eine Kontamination und ein unnötiges Auftauen der NNT-Proben vermeiden, z.B. durch Aliquotierung.

Die Asservierung von Plasma/Serum über das Eintrocknen an Filterpapieren (Guthrie cards) stellt zukünftig möglicherweise eine Alternative zum Einfrieren dar.

Die angereicherte Nukleinsäure ist solange bei -30°C aufzubewahren, bis ein eindeutig negatives oder positives Ergebnis des NNT vorliegt. Bei fraglichen und positiven Ergebnissen in einer Probe bzw. Spende ist eine Wiederholung des NNT zügig aus dem Nukleinsäurenextrakt und zusätzlich aus dem Ausgangsmaterial ohne Vermischen mit einer anderen Probe durchzuführen.

Für das Aufbewahren der Nachuntersuchungsproben sind Geräte, Räumlichkeiten und Kontrollbedingungen zu verwenden, die die GMP-Bedingungen erfüllen.

12. Testprotokoll und Freigabe der Spenden

Über jeden NNT muss ein ausreichendes Protokoll vorhanden sein, aus dem hervorgeht, wieviele Proben in einem Testlauf analysiert worden sind und wieviele vermischte Proben mit welchen Verfahren und Chargen von Reagenzien analysiert wurden. Ferner muss ersichtlich sein, wie das Ergebnis der Kontrollen ausfiel und wer an der Testdurchführung beteiligt war. Dieses Protokoll ist 10 Jahre aufzubewahren. Eine sichere EDV-kompatible Aufbewahrung der Protokolle ist statthaft, wenn der Zugriff auf die Daten in angemessener Zeit sichergestellt wird.

Nur bei einwandfreiem Ergebnis der Kontrollen und bei Überprüfen der Analyse durch eine an der Analyse nicht beteiligte Person können Spenden mit negativem NNT-Ergebnis vom Kontrollleiter freigegeben werden. Proben, deren Ergebnis im fraglichen oder im positiven Bereich lagen, müssen weiteren NNT Untersuchungen zugeführt werden. Durch zusätzliche serologische Tests muss das NNT Ergebnis soweit möglich auf Plausibilität überprüft und durch Analyse von Nachbarproben das Risiko einer Kontamination ermittelt werden.

Für den Arbeitskreis Blut:

Prof. Dr. R. Burger, Vorsitzender
Prof. Dr. R. Kroczek, Geschäftsführer

Stand: 09.12.2004

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