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91. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

Erteilt am 05.03.2014. Genehmigung erweitert am 12.05.2015 (siehe 2.).

1. Genehmigungsinhaber

Herr Dr. Leo Kurian, Universität Köln

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

  • H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
  • H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)

Im Rahmen der Erweiterung der Genehmigung vom 12.05.2015 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen der folgenden weiteren Linie genehmigt:

  • HUES 6 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)

Die Genehmigung gilt auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist die Aufklärung der Funktion von sogenannten langen nicht-codierenden RNAs (long non-coding RNAs, lncRNAs) bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz, bei der Differenzierung pluripotenter Stammzellen in kardiale und vaskuläre Zellen sowie bei der Regeneration des Herzens und des vaskulären Systems. Aufbauend auf Arbeiten, die der Antragsteller unter Nutzung von hES-Zellen in der Vergangenheit im Ausland durchgeführt hat, sollen zunächst bereits identifizierte lncRNAs, deren Expression in humanen pluripotenten bzw. sich kardiovaskulär differenzierenden Zellen verstärkt ist, hinsichtlich ihrer Relevanz für Pluripotenz bzw. Differenzierung untersucht werden. Dazu sollen in hES-Zellen die Expression verschiedener lncRNAs gehemmt und der Effekt auf die Pluripotenz der hES-Zellen sowie deren Vermögen zur Differenzierung in verschiedene (Vorläufer)Zellen der kardialen Linie bestimmt werden. Ferner soll die Präsenz von lncRNAs, die im sich regenerierenden Herzen des Zebrafisches verstärkt auftreten, in aus hES-Zellen gewonnenen kardialen Vorläuferzellen bzw. reifen Kardiomyozyten überprüft und eine mögliche Rolle dieser lncRNAs bei der Proliferation bzw. Dedifferenzierung von kardialen Zellen ermittelt werden. Schließlich sollen die als für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz bzw. kardiale Differenzierung als wesentlich identifizierten lncRNAs u. a. bezüglich ihrer intrazellulären Lokalisation, hinsichtlich potentieller Wechselwirkungen mit RNAs und Proteinen sowie mit Blick auf ihre funktionell aktiven Sequenzen untersucht werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung und des RKI vornehmlich hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich::

Im Rahmen des Forschungsvorhabens soll die spezifische Funktion von lncRNAs, die in hES-Zellen angereichert sind, bestimmt werden. Dabei soll vor allem der Frage nachgegangen werden, ob und inwieweit zuvor bereits identifizierte, in hES-Zellen verstärkt auftretende lncRNAs für die Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustandes von hES-Zellen essentiell sind und welche spezifischen Funktionen sie dabei haben. Insbesondere soll die mögliche Rolle von lncRNAs bei der Aufrechterhaltung einer spezifischen epigenetischen Architektur und bei der durch mikro-RNAs (miRNAs) vermittelten Regulation von Schlüsselfaktoren der Pluripotenz aufgeklärt werden. Die daraus erwarteten Erkenntnisse können voraussichtlich zu einem verbesserten Verständnis der Grundlagen von Pluripotenz menschlicher Zellen beitragen und künftig ggf. Basis für verbesserte Kultivierungsprotokolle für diese Zellen sein.

Weiterhin soll geklärt werden, ob die Ausschaltung bestimmter lncRNAs, die in einzelnen Stadien sich kardial entwickelnder Zellen angereichert sind, einen Einfluss auf das kardiale Differenzierungsvermögen der betreffenden Zellen hat. Der Schwerpunkt liegt dabei auf der Untersuchung der Rolle von lncRNAs bei Spezifizierung pluripotenter Stammzellen für die mesodermale Linie und der Entwicklung kardialer Vorläufer sowie auf der Analyse einer möglichen lncRNA-Funktion bei deren Entwicklung zu Kardiomyozyten und endothelialen Zellen. Im Ergebnis dieser Arbeiten soll ein Pool von relevanten lncRNAs identifiziert werden, deren knock down die kardiale Differenzierung beeinträchtigt und die folglich in bestimmte Schritte der Bildung kardialer und endothelialer Zellen involviert sind. Im Falle der Identifizierung entsprechender lncRNAs sollen deren intrazelluläre Lokalisationen bestimmt, die durch ihren knock out bewirkten Veränderungen im globalen Transkriptom ermittelt und potentielle Wechselwirkungspartner dieser lncRNAs identifiziert und verifiziert werden. Aus diesen Untersuchungen können sich Erkenntnisse über Pluripotenz und kardiale Differenzierungsprozesse beim Menschen und daran beteiligte Moleküle und Signalwege ergeben. Insbesondere könnten Kenntnisse über die derzeit wenig verstandenen Funktionen von zelltypspezifischen lncRNAs und darüber gewonnen werden, auf welcher molekularen Ebene sie Pluripotenz regulieren bzw. in die kardiale Differenzierung eingreifen können. Ggf. können die erzielten Erkenntnisse auch zu einer weiteren Optimierung von In-vitro-Protokollen für die kardiale Differenzierung beitragen.

Schließlich soll die Frage untersucht werden, ob im Zebrafisch identifizierte lncRNAs, die im Zusammenhang mit der Herzregeneration verstärkt auftreten, ggf. eine Rolle bei der Regeneration des menschlichen Herzens spielen könnten. Durch die Überexpression bzw. Repression der entsprechenden lncRNAs in diesen Zellen und durch Bestimmung der Effekte insbesondere auf das zelluläre Proliferationsvermögen sollen Anhaltspunkte dafür gewonnen werden, ob lncRNAs ggf. Komponenten eines molekularen Netzwerkes sind, das die Regeneration des menschlichen Herzens kontrolliert. Die Identifizierung von Molekülen und Signalwegen, die an regenerativen Prozessen im Herzen beteiligt sind, kann von erheblicher Bedeutung für das derzeit nur geringfügige Verständnis der Herzzell-Regeneration beim Menschen sein.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Eine Rolle von lncRNAs bei der Regulation von Pluripotenz in murinen ES-Zellen ist in der Literatur ebenso belegt wie Veränderungen in der Expression spezifischer lncRNAs bei spontaner Differenzierung dieser Zellen. Weitere Studien ergaben Hinweise darauf, dass lncRNAs integrale Bestandteile des Netzwerks sind, das in murinen ES-Zellen Pluripotenz reguliert. Ferner wurden bereits mehrere lncRNAs in hES-Zellen identifiziert, die zum Teil im Komplex mit Pluripotenzfaktoren vorliegen und deren knock down zur Induktion von Differenzierung, also zum Verlust der Pluripotenz, führt.

Auch zur Rolle von lncRNAs bei der kardialen Differenzierung von murinen ES-Zellen bzw. im Mausembryo liegen mehrere Studien vor. So wurde beispielsweise gezeigt, dass die lncRNA AK143269 („Braveheart“, Bvht) für die Aktivierung einer Reihe von für die kardiale Differenzierung essentiellen Transkriptionsfaktoren notwendig ist und dass viele der von Bvht regulierten Gene auch durch den Master-Regulator der kardialen Differenzierung, MESP1, reguliert werden. Für die spezifisch in Zellen des lateralen Plattenmesoderms exprimierte lncRNA JQ973641 (Fetal-lethal noncoding developmental regulatory RNA, Fenddr) wurde gezeigt, dass sie über die Modulation von Chromatin-Signaturen und damit verbunden über eine Beeinflussung der Genaktivität die Herzzellentwicklung der Maus reguliert und dass ein Knock out von Fenddr zum Absterben der betroffenen Mausembryonen infolge einer Hypoplasie des Myokards führte. Diese Studien lassen es plausibel erscheinen, dass lncRNAs auch an der kardialen Differenzierung beim Menschen beteiligt sind.

Der Genehmigungsinhaber selbst hat im Ausland Arbeiten an hES-Zellen durchgeführt, in deren Rahmen er eine Reihe humaner lncRNAs identifiziert hat, die zelltypspezifisch in hES-Zellen bzw. in sich kardial bzw. endothelial oder vaskulär differenzierenden Zellen exprimiert werden. Mehr als die Hälfte des in diesen Zellen aktiven Transkriptoms der sich differenzierenden Zellen wird von lncRNAs okkupiert, was auf eine wesentliche Rolle dieser Klasse von regulatorischen RNAs bei der Differenzierung hinweist. Für einige lncRNAs wurde bereits gezeigt, dass ihre Expression mit jener von Genen für Transkriptionsfaktoren, die für das jeweilige Entwicklungsstadium bestimmend sind, korreliert ist und dass diese lncRNAs essentiell für die Aufrechterhaltung von Pluripotenz, für die Spezifizierung zu Mesoderm bzw. für die Aufrechterhaltung des Proliferationsvermögens kardialer Vorläuferzellen sind.  Darüber hinaus wurde dargelegt, dass die methodischen Vorgehensweisen (beispielsweise für die kardiale Differenzierung humaner ES-Zellen) bereits etabliert und erprobt worden sind.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Ein erstes Forschungsziel besteht in der Aufklärung der Rolle zelltypspezifischer lncRNAs, d. h. es soll hier die Funktion jener lncRNAs bestimmt werden, die in pluripotenten Stammzellen, nicht aber in deren differenzierten Derivaten anzutreffen sind.  Folglich sind zur Erreichung der Forschungsziele pluripotente Stammzellen erforderlich. Weiterhin ist die Mehrheit der bislang identifizierten humanen lncRNAs speziesspezifisch, so dass ihre Funktion im Menschen nicht an tierischen Zellen, z. B der Maus, aufgeklärt werden kann. Die molekularen Grundlagen von Pluripotenz, deren mögliche Regulation durch lncRNAs hier erforscht werden soll, sind zudem in pluripotenten Zellen verschiedener Spezies unter In-vitro-Bedingungen bekanntermaßen voneinander verschieden, was die Nutzung humaner pluripotenter Stammzellen erforderlich macht.

Ein weiteres Forschungsziel besteht in der Aufklärung der Rolle von lncRNAs während der kardialen Differenzierung und Herzzellregeneration beim Menschen. Die Erreichung dieses Forschungsziels erfordert ebenfalls die Nutzung menschlicher Zellen, da sich die kardiale Differenzierung zwischen verschiedenen Spezies unterscheidet und insbesondere erhebliche Unterschiede zwischen Maus und Mensch bestehen. Die Notwendigkeit der Nutzung menschlicher Zellen ergibt sich auch aus den bereits o. g. spezies-spezifischen Besonderheiten bezüglich der lncRNAs. Die für das Forschungsvorhaben erforderlichen Zellen verschiedener, voneinander gut abgrenzbarer kardiovaskulärer Entwicklungsstadien (mesodermale Vorläuferzellen, kardiale und vaskuläre Vorläuferzellen, terminal differenzierte Kardiomyozyten, Endothelzellen) können in der hier erforderlichen Menge und Qualität derzeit allein aus pluripotenten Zellen reproduzierbar gewonnen werden. Frühe Entwicklungsstadien kardialer Zellen sind derzeit allein durch eine gerichtete Differenzierung pluripotenter Stammzellen zugänglich; andere Zelltypen (wie beispielsweise fötale kardiale Zellen oder adulte kardiale Stammzellen) haben die hier interessierenden Differenzierungsstadien bereits durchlaufen und können somit nicht zur Erreichung der Forschungsziele verwendet werden. Zudem haben fötale und adulte Stammzellen ein limitiertes Proliferations- und Differenzierungsvermögen in vitro, das eine Bereitstellung von für die Projektdurchführung ausreichenden Zellmengen in reproduzierbarer Qualität derzeit nicht erlaubt, so dass auch Zellen späterer Differenzierungsstadien nicht in für die Projektdurchführung notwendiger Menge aus diesen Zellen gewonnen werden können.

Es wurde ferner dargelegt, dass nach derzeitigem Kenntnisstand auch keine Belege dafür vorliegen, das die Forschungsziele unter alleiniger Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) zu erreichen sind. Zum einen bestehen Unterschiede im Epigenom von hES- und hiPS-Zellen. Da ein wesentlicher Teil der lncRNA-Aktivität aber offenbar gerade das Epigenom betrifft, kann derzeit nicht abgeschätzt werden, ob und inwieweit die Funktion von lncRNAs in beiden Zelltypen identisch ist oder ggf. reprogrammierungsbedingte Artefakte bezüglich der Funktion von lncRNAs in hiPS-Zellen zu erwarten sind. Zum anderen wurden Unterschiede in der Expression von lncRNAs in embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen der Maus beschrieben, und es ist nicht bekannt, ob diese auch in humanen Zellen bestehen.

Stand: 12.05.2015

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