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84. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

Erteilt am 26.09.2013. Genehmigung erweitert am 30.10.2014 (siehe 2.) und 12.10.2015 (siehe 6.)

1. Genehmigungsinhaber

Herr Dr. David Vilchez, Universität Köln

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten basieren auf humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) der folgenden Linien:

  • H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
  • HUES 6 (Harvard University Cambridge, MA, USA)

Im Rahmen der Erweiterung der Genehmigung vom 30.10.2014 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen der folgenden weiteren Linien genehmigt:

  • H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
  • HUES 1 (Harvard University Cambridge, MA, USA)
  • HUES 9 (Harvard University Cambridge, MA, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten ist es, die Mechanismen der Aufrechterhaltung der Protein-Integrität (Proteostase) in humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) zu untersuchen und dadurch zu neuen Erkenntnissen über die molekularen Grundlagen der Regulation der Lebensdauer von Zellen und von zellulären Alterungsprozessen zu gelangen. Auf Grundlage vorangegangener Forschungen, in denen eine außergewöhnlich hohe Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems in hES-Zellen festgestellt und ein an der Regulation der Proteasom-Aktivität beteiligter maßgeblicher Faktor identifiziert wurde, sollen durch vergleichende Untersuchungen der Proteome von hES-Zellen und von aus diesen differenzierten Zellen weitere Faktoren und Signalwege identifiziert werden, die für die erhöhte Proteasom-Aktivität in hES-Zellen verantwortlich sind. Ferner soll überprüft werden, ob und inwieweit weitere Proteinkomplexe und Signalwege, die an der Aufrechterhaltung der Proteostase in eukaryontischen Zellen beteiligt sind, in hES-Zellen eine höhere Aktivität aufweisen als in differenzierten Zellen. Die Relevanz der dabei identifizierten Proteine für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz soll dann durch Modulation der Expression der jeweiligen Gene in hES-Zellen untersucht und die Rolle dieser Gene bei der Reprogrammierung somatischer Zellen zu humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) sowie bei der Transdifferenzierung zu neuralen Zellen analysiert werden. Weiterhin soll durch Modulation der Expression von spezifischen Ubiquitin-Ligasen deren Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz von hES-Zellen bestimmt sowie ggf. ihre Substrat-Proteine identifiziert werden. Die Gene, die für diese Proteine codieren, sollen dann in hES-Zellen überexprimiert werden, um Aufschluss darüber zu erhalten, welche spezifische Funktion der regulierte Abbau ihrer Genprodukte für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz von hES-Zellen hat. Schließlich sollen auf verschiedenen Wegen molekulare Mechanismen identifiziert werden, die in pluripotenten Stammzellen zur Verminderung von proteotoxischem Stress beitragen.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung und können darüber hinaus zur Schaffung von Grundlagen für die Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen beitragen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Aufbauend auf Daten, die im Rahmen von im Ausland durchgeführten Forschungen des Genehmigungsinhabers zur Proteostase in hES-Zellen durchgeführt wurden, sollen nunmehr durch Vergleich des Proteoms von hES-Zellen und aus ihnen differenzierten neuralen Zellen weitere Kandidaten-Proteine identifiziert werden, die möglicherweise an der Regulation der Protostase in hES-Zellen beteiligt sind. Dabei sollen neben Komponenten des Proteasoms auch Bestandteile anderer Protein-Abbauwege analysiert und – u. a. durch knock down bzw. knock out der Expression von entsprechenden Kandidaten-Genen in hES-Zellen und aus diesen differenzierten Derivaten – ihre potentielle Rolle bei der Aufrechterhaltung der Proteinintegrität in diesen Zellen geklärt werden. Diese Untersuchungen können zu einem besseren Verständnis darüber führen, welche Moleküle und Signalwege zur Aufrechterhaltung der Integrität des Proteoms in hES- beitragen, welche Veränderungen hierbei im Zuge der Differenzierung insbesondere zu neuralen Zellen auftreten und welche Defizite in der Regulation der Proteostase ggf. mit degenerativen Prozessen im Nervensystem einhergehen. Es sind Erkenntnisse darüber zu erwarten, auf welchem Wege die Pluripotenz von hES-Zellen auf der Ebene der Proteoms reguliert wird und wie Differenzierungs- und Alterungsprozesse mit einer Umstellung der Proteostase-Regulation verbunden sind. Die Analysen könnten zudem auch  Anhaltspunkte dafür ergeben, welche für die Regulation der Proteostase relevanten Proteine für die Entstehung  degenerativer Erkrankungen des Nervensystems (wie beispielsweise Morbus Parkinson oder Morbus Alzheimer) relevant sind, was mittelfristig der Identifizierung neuer targets für die Behandlung dieser Erkrankungen dienen könnte.

Die an hES-Zellen gewonnen Erkenntnisse sollen dann auf weitere Zellsysteme angewandt werden. Zum einen soll überprüft werden, ob die als für die Proteostase in hES-Zellen als wesentlich erkannten Moleküle und Signalwege auch für die Etablierung von Pluripotenz in hiPS-Zellen im Zuge der Reprogrammierung von Bedeutung sind und wie dies reguliert wird, was voraussichtlich zu einem vertieften Verständnis über Gemeinsamkeiten und potentielle Unterschiede zwischen hES- und hiPS-Zellen auf der Ebene Proteomstabilität beitragen kann. Zum anderen soll geklärt werden, ob in hES-Zellen identifizierte Regulatoren der Proteom-Stabilität auch für die Transdifferenzierung fötaler und postnataler Fibroblasten in Zellen mit Eigenschaften neuraler Zellen (sog. induzierte Neuronen) erforderlich sind, woraus sich ggf. neue Erkenntnisse über die molekularen Grundlagen von neuraler Transdifferenzierung auf der Ebene der Regulation des Protein-Umsatzes ergeben können.

Ferner soll untersucht werden, welche Rolle die für die Proteostase in hES-Zellen maßgeblichen Faktoren und Signalwege bei Alterungsvorgängen spielen. Durch Modulation der Expression der Orthologen jener Gene, deren Produkte in hES-Zellen Ziel einer erhöhten proteolytischen Aktivität sind, soll im Fadenwurm C. elegans soll überprüft werden, ob dies zu einer Verlängerung der Lebensspanne von C. elegans führt.  Die Analyse der entsprechenden Phänotypen und der ihnen zugrundeliegenden molekularen Veränderungen kann ggf. zur Klärung der Frage beitragen, auf welche Weise Alterungsprozesse mit einer veränderten Proteostase verbunden sind und welche Faktoren dabei eine Schlüsselrolle spielen. Schließlich sollen die Untersuchungen auf Modelle für neurodegenerative Erkrankungen ausgedehnt werden, die ebenfalls auf C. elegans basieren. In diesen Modellsystemen werden mutierte humane Gene, deren Produkte einer Fehlfaltung unterliegen und infolgedessen Erkrankungen wie Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer oder Morbus Huntington verursachen können, in C. elegans überexprimiert. Untersucht werden soll, ob die ektopische Expression von für die Proteostase in hES-Zellen relevante Proteinen zu einer Verminderung der Akkumulation der (zelltoxischen) fehlgefalteten Proteine führt. Dies könnte das Verständnis über die diesen Krankheiten möglicherweise zugrundeliegenden Defekte in der Proteostase verbessern helfen und ggf. zur Schaffung von Grundlagen für die künftige Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze zur Behandlung der entsprechenden Erkrankungen beitragen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen em­bryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Die essentielle Bedeutung des Ubiquitin-Proteasom-Systems für die Pluripotenz muriner ES-Zellen ist  in der Literatur beschrieben. In einer jüngst publizierten Arbeit hat der Genehmigungsinhaber zudem nachgewiesen, dass hES-Zellen eine im Vergleich mit differenzierten Zellen erheblich erhöhte Aktivität des Proteasoms aufweisen, wobei als ein für diese hohe Proteasom-Aktivität maßgeblicher Faktor PSMD11 (eine Komponente der 19s-Untereinheit des Proteasoms) identifiziert wurde, dessen Expression durch den Transkriptionsfaktor FOXO4 reguliert wird. Während die Hemmung der Expression von FOXO4 in hES-Zellen die Proteasom-Aktivität deutlich reduzierte und eine konstitutiv aktive FOXO4-Mutante die Proteasom-Aktivität in hES-Zellen weiter steigerte, hatte ein knock down von FOXO4 keinen Effekt auf die Integrität der hES-Zellen, so dass offenbar weitere Faktoren für den beobachteten Zusammenhang zwischen der Pluripotenz der hES-Zellen und einer hohen Proteasom-Aktivität relevant sind. Diese Faktoren sollen im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten identifiziert werden.

In einer weiteren unlängst publizierten Arbeit konnte der Genehmigungsinhaber zeigen, dass genetisch determinierte Langlebigkeit in C. elegans mit einer erhöhten Proteasom-Aktivität assoziiert ist, was ebenfalls mit der verstärkten Präsenz einer Komponente der 19s-Untereinheit (RNP-6.1) korreliert war. Die erhöhte Expression des entsprechenden Gens steht hier mit der verstärkten Aktivität des Transkriptionsfaktors DAF-16 in Zusammenhang, des C. elegans-Orthologen der humanen FOXO-Transkriptionsfaktoren. Repression von RNP-6.1 bewirkte eine deutliche Verkürzung der Lebensspanne der C. elegans-Mutanten, und die Überexpression von RNP-6.1 vermittelte eine erhöhte Resistenz gegenüber beispielsweise oxidativem oder thermischen Stress. Die Auffassung, dass eine verlängerte  (zelluläre) Lebensspanne ggf. mit einer erhöhten Proteasom-Aktivität einhergeht, ist folglich plausibel und begründet die Hypothese des Genehmigungsinhabers, dass die Aufrechterhaltung der Pluripotenz von hES-Zellen maßgeblich an die Kontrolle der Proteostase gebunden sein könnte.

Ferner hat der wurde dargelegt, dass die Überexpression des Gens für RPN-6.1 in einem auf C. elegans basierendem Krankheitsmodell für Morbus Huntington zu einer deutlichen Reduktion der PolyQ-bedingten Toxizität und einer erhöhten Motilität führten, während der Verlust der rnp-6.1-Expression eine Verstärkung des pathogenen Phänotyps bewirkte. Insofern ist das Forschungsziel, durch Analyse der Veränderungen in der Proteostase im Zuge der neuralen Differenzierung ggf. auch einen Beitrag zum besseren Verständnis der molekularen Grundlagen degenerativer Erkrankungen leisten zu können, gut begründet.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

In vorangegangenen Arbeiten des Genehmigungsinhabers wurde gezeigt, dass bereits frühe differenzierte Derivate von hES-Zellen, beispielsweise neurale Vorläuferzellen, eine deutlich verringerte Proteasom-Aktivität aufweisen als hES-Zellen. Es ist folglich davon auszugehen, dass in (Stamm)Zellen, die sich nicht mehr im Stadium der Pluripotenz befinden (beispielsweise fötale Zellen oder adulte Stammzellen), die Regulation der Proteostase andere Grundlagen hat als in pluripotenten Stammzellen, was die Verwendung pluripotenter Stammzellen zur Klärung der formulierten Forschungsfragen erforderlich macht.

Für die Erreichung der Forschungsziele können auch keine tierischen, insbesondere keine murinen pluripotenten Stammzellen, genutzt werden. Zwar spielt auch in murinen ES-Zellen das Ubiquitin-Proteasom-System eine maßgebliche Rolle für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz. Jedoch sind hier offenbar andere Faktoren beteiligt als in humanen ES-Zellen. So wurde nachgewiesen, dass insbesondere die Deubiquitinase-Aktivität der 19S Proteasom-Komponente PSMD14 sowie die die E3-Ubiquitin-Ligase Fbxw7 in murinen ES-Zellen eine zentrale Rolle für die Aufrechterhaltung des Selbsterneuerungsvermögens bzw. für die Differenzierungsinduktion spielen. Für hES-Zellen wurde dagegen eine essentielle Funktion von PSMD11 für die Proteostase nachgewiesen. Die an der Regulation der Proteostase beteiligten Moleküle und Signalwege sind folglich zwischen embryonalen Stammzellen verschiedener Spezies zumindest teilweise verschieden, was die Übertragung von an tierischen pluripotenten Zellen gewonnenen Ergebnissen auf das humane System nicht ohne weiteres zulässt. Um die hier angestrebten Erkenntnisse gewinnen zu können, werden daher humane pluripotente Stammzellen benötigt.

Die angestrebten Forschungsziele können auch nicht unter ausschließlicher Verwendung von hiPS-Zellen erreicht werden. Der Genehmigungsinhaber selbst hat in der Vergangenheit gezeigt, dass die Reprogrammierung humaner somatischer Zellen zu iPS-Zellen mit einer gesteigerten Proteasom-Aktivität und einem erhöhten Level von PSMD11 einhergeht. Weitere Eigenschaften von hiPS-Zellen bezüglich der Regulation ihrer Proteostase sind jedoch bislang nicht beschrieben worden, und es ist gerade Gegenstand des geplanten Forschungsvorhabens, hES- und hiPS-Zellen bezüglich ihrer Gemeinsamkeiten und möglicher Unterschiede in der Regulation der Proteostase vergleichend zu analysieren. Dies erfordert aber die Verwendung von hES-Zellen.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 12.10.2015

Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Bei der Durchführung genehmigter Forschungsarbeiten wurde durch Vergleich der Proteome undifferenzierter und differenzierter hES-Zellen festgestellt, dass Gene, die für sog. Kälteschockproteine (cold shock proteins, CSPs) codieren, in hES-Zellen in starkem Maße exprimiert werden, jedoch in geringeren Mengen in aus hES-Zellen differenzierten Zellen vorliegen. CSPs können durch Bildung von Komplexen mit Ribosomen und Bindung von mRNA die Translationsrate regulieren und so einen Beitrag zur Proteostase in Zellen leisten. Im Rahmen der nun genehmigten Forschungsarbeiten soll geklärt werden, ob und wenn ja auf welchem Wege bestimmte CSPs die Eigenschaften von hES-Zellen modulieren können und welche molekularen Grundlagen dies hat. Entsprechende Untersuchungen sollen auch an hiPS-Zellen durchgeführt werden.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen in erster Linie hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Die genehmigten Forschungsarbeiten stellen eine Weiterentwicklung des bereits in der Vergangenheit genehmigten Forschungsvorhabens dar, das zur Aufklärung der molekularen Grundlagen der Proteostase in hES-Zellen beitragen soll. Die Erforschung der Grundlagen der Proteostase in humanen pluripotenten Stammzellen stellt ein hochrangiges Forschungsziel dar. Im Ergebnis der vergleichenden quantitativen Analysen der Proteome von hES-Zellen und von aus diesen abgeleiteten neuralen Zellen wurde festgestellt, dass CSP-Gene in hES-Zellen stärker exprimiert werden als in differenzierten Zellen. Da CSPs als Bestandteile von Ribonukleoprotein-Komplexen über die Bindung von RNA offenbar die Translationsrate verschiedener mRNAs beeinflussen, spielen sie ggf. bei der Aufrechterhaltung der Proteostase von hES-Zellen, und damit ggf. für die Aufrechterhaltung von deren Pluripotenz, eine Rolle. Aus diesem Grunde sollen die Untersuchungen nun auf CSPs ausgedehnt und zusätzliche Experimente durchgeführt werden, insbesondere zur Identifikation von Genen, deren Produkte ggf. einer Regulation durch CSPs unterliegen, zur Bestimmung von Interaktionspartnern von CSPs auf RNA- und Proteinebene und damit letztlich zur Identifizierung von Signalwegen, über die CSPs die Proteostase in hES-Zellen mutmaßlich beeinflussen. Angesichts der Tatsache, dass bislang nur wenig über die Proteostase von hES-Zellen und so gut wie gar nichts über die Rolle von CSPs für deren Aufrechterhaltung bekannt ist, könnten die nun geplanten Forschungsarbeiten wie schon die zuvor genehmigten Arbeiten dazu beitragen, Grundlagen der Aufrechterhaltung der Proteostase und damit der Pluripotenz in menschlichen Zellen aufzuklären. Zudem ist vorstellbar, dass die angestrebten Erkenntnisse zur Rolle von CSPs in menschlichen pluripotenten Stammzellen auch zu einem besseren Verständnis früher Differenzierungsprozesse in menschlichen Zellen beitragen. Verbunden mit Experimenten, die parallel in C. elegans zur Bestimmung der möglichen Funktion von CSPs durchgeführt werden sollen, können die beantragten Arbeiten auch dazu beitragen, die molekularen Grundlagen zellulärer Alterungsprozesse aufzuklären. Die Aufklärung von molekularen Prozessen, die zur Integrität des Proteoms beitragen, ist mit Blick auf die Grundlagenforschung von erheblichem Interesse. Sie ist aber auch für ein besseres Verständnis von Prozessen bedeutsam, die bei der krankheitsbedingten Degeneration von menschlichen Zellen eine Rolle spielen, da degenerative Erkrankungen des Menschen teils mit einer verminderten Fähigkeit der Zellen zur Aufrechterhaltung ihres Proteoms einhergehen.

Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen erforderlich ist.

Die Vorklärung der mit dem Vorhaben verfolgten wissenschaftlichen Zielstellungen, die durch die nunmehr beantragten Forschungsarbeiten nicht grundsätzlich verändert sind, wurde im ursprünglichen Antragsverfahren umfänglich dargelegt. Zusätzlich wurden nun Daten zur Vorklärung der zusätzlich geplanten Forschungsfragen wie der Ergründung der Rolle von CSPs in hES-Zellen vorgetragen. Im Rahmen der Durchführung bislang genehmigter Forschungsarbeiten wurden beispielsweise quantitative Proteomanalysen in hES-Zellen durchgeführt, in deren Ergebnis eine verstärkte Präsenz von CSPs in hES-Zellen festgestellt wurde. Infolge des knock down eines der entsprechenden Gene zeigten die betreffenden hES Zellen beispielsweise eine deutliche Veränderung bestimmter mit Pluripotenz assoziierter Eigenschaften. Zudem konnten Veränderungen im Differenzierungspotential der betreffenden hES-Zellen festgestellt werden.

Die bereits oben genannten Gründe für die Notwendigkeit der Verwendung von hES-Zellen gelten unverändert fort. Übergeordnete Zielstellung der beantragten Forschungsarbeiten ist es weiterhin, die molekularen Grundlagen für die Regulation der Proteostase in pluripotenten Stammzellen des Menschen und ihre Rolle für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz besser als bislang zu verstehen. Die in hES-Zellen bereits in der Vergangenheit beobachtete erhöhte Proteasom-Aktivität ist offenbar ein kennzeichnendes Merkmal pluripotenter Stammzellen; bereits frühe differenzierte Derivate von hES-Zellen, beispielsweise neurale Vorläuferzellen, weisen eine deutlich verringerte Proteasom-Aktivität auf als hES-Zellen. Es ist folglich davon auszugehen, dass in Zellen, die sich nicht mehr im Stadium der Pluripotenz befinden (beispielsweise fötale Zellen oder adulte Stammzellen), die Regulation der Proteostase andere Grundlagen hat als in pluripotenten Stammzellen, was die Verwendung pluripotenter Stammzellen zur Klärung der formulierten Forschungsfragen erforderlich macht.

Die angestrebten Forschungsziele können auch weiterhin nicht unter ausschließlicher Verwendung von hiPS-Zellen erreicht werden. Eigenschaften von hiPS-Zellen bezüglich der Regulation ihrer Proteostase sind auch weiterhin nur wenig verstanden. Zudem basieren die beantragten Forschungsarbeiten auf früheren Studien, denen zufolge hES-Zellen kontinuierlich replizieren, ohne Anzeichen von Seneszenz aufzuweisen. Dies ist für hiPS-Zellen bislang nicht gezeigt worden. Ferner ist es erheblich, dass hiPS-Zellen aus somatischen Zellen abgeleitet werden, die Alterungsprozesse bereits durchlaufen haben. Ob und inwiefern die Spuren dieser Alterungsprozesse auf molekularer Ebene im Zuge der Reprogrammierung vollständig rückgängig gemacht werden und ob hES-Zellen und hiPS-Zellen bezüglich der Regulation ihrer Proteostase identisch sind, ist derzeit offen. Hinzu kommt die ungeklärte Frage, ob und inwieweit genetische Veränderungen in den somatischen Zellen, aus denen die hiPS-Zellen abgeleitet wurden, sowie genetische und epigenetische Veränderungen im Reprogrammierungsprozess ggf. auch zu Veränderungen des regulatorischen Netzwerkes führen, das die Integrität des Proteoms in pluripotenten Stammzellen des Menschen aufrechterhält. Außerdem ist es auch weiterhin Gegenstand des gesamten Forschungsvorhabens, hES- und hiPS-Zellen bezüglich ihrer Gemeinsamkeiten und möglicher Unterschiede in der Regulation der Proteostase und hier insbesondere bezüglich der Rolle von CSPs in diesen Prozessen zu analysieren und zu vergleichen. Dies ist aber nur unter Verwendung von hES-Zellen möglich.

Stand: 12.10.2015

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