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Zielgruppeneinstiege

Aktuelle Projekte der Projektgruppe 5

Hintergrund

Salmonellosen sind mit 24.456 Fällen im Jahr 2011 eine der am häufigsten auftretenden bakteriellen Infektionskrankheiten in Deutschland. Die tatsächliche Häufigkeit dürfte durch die Nichterfassung milder Verläufe weitaus höher liegen. Als Erreger von Salmonellosen beim Menschen treten in ca. 70% aller Fälle die Serovare Typhimurium und Enteritidis auf. Beide Serovare besitzen ein breites Wirtsspektrum und vor allem Nutztierbestände stellen ein stetes Reservoir für diese Salmonellen dar. Von den mehr als 2500 beschriebenen Serovaren von Salmonella enterica sind jedoch einige stark an den Menschen angepasst. Die Serovare Typhi, Paratyphus A, B und C können dabei schwerwiegende systemische Infektionen verursachen. Serovar Typhi spielt als Erreger von Typhus abdominalis mit 57 gemeldeten Fällen in Deutschland (2011) fast ausschließlich als reiseassoziierte Krankheit eine Rolle. Diese Bakterien sind in vielen Teilen Südostasiens sowie in Ländern mit unzureichenden hygienischen Verhältnissen endemisch. Besorgniserregend ist der Anstieg multiresistenter Isolate aus diesen Ländern in den letzten Jahren. Ein weiterer Trend, wahrscheinlich ausgelöst durch gezielte Bekämpfung von Salmonella Typhi mittels Impfungen, ist die rasche Ausbreitung von NTS (nontyphoidal Salmonella) mit schweren systemischen Verläufen. Infektionen mit NTS umfassen hauptsächlich die Serovare Typhimurium sowie Enteritidis und stellen ein großes Problem in Sub-Sahara Afrika mit hoher Letalität unter Kindern und HIV-positiven Erwachsenen dar. Obwohl die hygienischen Standards als auch der durchschnittliche Immunstatus der Bevölkerung in Deutschland wesentlich höher sind, stellt die Ausbreitung dieser Krankheitserreger eine latente Gefahr dar. Durch den globalisierten Güter- und Personenverkehr können sich mit den Erregern ihre unerwünschten Eigenschaften (z.B. Antibiotikaresistenzen) schnell in der Population verbreiten.

Forschungsprojekte

Mechanismus der SPI-4 Funktion

Ein sogenanntes Typ I Sekretionssystem (T1SS) wird von der innerhalb der Gattung Salmonella weit verbreiteten Salmonella Pathogenitätsinsel 4 (SPI-4) kodiert. SPI-4 wurde als wichtiger Faktor für die Kolonisierung von Rindern gefunden, wird aber auch von Bakterien im Blut von Sepsispatienten exprimiert. Wir konnten zeigen, dass das Substrat des von siiCDF kodierten T1SS SiiE ist - ein riesiges, repetitives Protein. SiiE kann die Anheftung der Bakterien spezifisch an polarisierte Epithelzellen vermitteln (Gerlach et al. 2007). Das aus polarisierten Zellen bestehende Darmepithel stellt eine der wichtigsten Barrieren des Körpers gegen invasive Bakterien wie Salmonellen dar.

Hier sehen Sie eine Abbildung von Salmonella Typhimurium mit polarisierten Epithelzellen. Quelle: Gerlach/RKIAbbildung 1: Interaktion von Salmonella Typhimurium mit polarisierten Epithelzellen. 3D-Rekonstruktion von konfokalen Mikroskopiedaten zeigt Salmonellen (grün) mit SiiE an der Oberfläche (rot) auf Epithelzellen (A, blau). B: Vergrößerung der Bakterien. Quelle: Gerlach/RKI

Die Funktionsweise dieses Systems stellt in mehrerlei Hinsicht eine Besonderheit dar: SiiE als Adhäsin ist für die Vermittlung der Anheftung nicht permanent an die Bakterienoberfläche gebunden, sondern wird hauptsächlich in das umgebende Medium abgegeben. Bei Wirtszellkontakts kann das Protein jedoch auf der Oberfläche der Bakterien nachgewiesen werden (Abb. 1).

Um weitere Erkenntnisse über den zugrundeliegenden Mechanismus zu erlangen, nutzen wir Epitop-markierte SPI-4 Komponenten zur Identifizierung von unbekannten Interaktionspartnern. Nach crosslinking werden die Komplexe über das Epitop des bait Proteins affinitätschromatographisch gereinigt und anschließend der Massenspektrometrie zugeführt. Frühere Ergebnisse konnten bereits eine enge regulatorische (Gerlach et al. 2007a) und funktionelle (Gerlach et al. 2008) Verbindung zwischen dem SPI-4 T1SS und dem SPI-1 T3SS nachweisen. Wir hoffen, dass unsere Interaktionsstudien einen tieferen Einblick in die Einbindung von SPI-4 in dieses und weitere Netzwerke erlauben.
Ein weiterreichendes Verständnis dieses Mechanismus könnte nicht nur helfen, mehr über die Interaktion von Salmonellen mit dem Darmepithel und die Grundlagen der Salmonellen-Enteritis zu erfahren, sondern auch diese Erkenntnisse in neue Therapiekonzepte umzusetzen. Zum einen könnte die Anheftung von SiiE an die Wirtszelle verhindert werden (Antiadhäsionsstrategie), zum anderen könnten die Mechanismen der Wirtserkennung der Salmonellen inhibiert werden. Beide Strategien würden zu einer stark verringerten Interaktion der Erreger mit dem Darmepithel führen und eine weitere Ausbreitung und Persistenz verhindern.

Gaussia princeps Luziferase als Reportergen in Salmonella

Die Luziferase des Ruderfußkrebses Gaussia princeps zeichnet sich durch eine Kombination aus geringer Proteingröße (~19,9 kDa) und extrem hoher Aktivität aus. Wir konnten Gluc als Reportergen für (i) Transkriptionsanalysen, (ii) Proteinsekretion und (iii) PCAs in S. Typhimurium etablieren (Wille et al. 2012).
Besonders interessant ist die Möglichkeit, mittels Gluc-PCA Protein-Protein Interaktionen in vivo zu evaluieren. Diese Methode soll zum einen zur Bestätigung als auch zur weiteren Charakterisierung (z.B. durch Mutagenese) von Protein-Protein Interaktionen in Salmonellen eingesetzt werden.
Die Nutzung von Gluc als hochsensitiven Sekretionsreporter wollen wir weiter ausbauen und ein Gluc-basiertes Transposon zur Identifizierung sekretierter Proteine von Salmonella entwickeln. Die Rolle der dadurch identifizierten Proteine für die Virulenz soll mittels im Labor etablierter Infektionsmodelle (polarisierte und nicht polarisierte Epithelzellen, Makrophagen) und anschließend im Mausmodell getestet werden.

Charakterisierung der SiiE-Sekretion

Die Sekretion des SPI-4-kodierten Adhäsins SiiE ist ein zentrales Element der SPI-4-vermittelten Adhäsion der Bakterien an polarisierte Epithelzellen und soll deswegen näher untersucht werden.
Über den exakten Mechanismus der Typ I Sekretion allgemein ist erstaunlich wenig bekannt. Nach neueren Erkenntnissen scheinen neben einer C-terminalen Signalsequenz für die eigentliche Sekretion weitere Domänen innerhalb von Typ I Substraten für die Erkennung durch das ABC Protein notwendig zu sein (Masi und Wandersman 2010). Unter Nutzung von Gluc-Fusionen mit verschieden langen C-terminalen Bereichen von SiiE und anschließender Quantifizierung der Sekretion dieser Fusionsproteine haben wir erste Hinweise darauf, dass dieser Mechanismus auch für SiiE zutrifft (Wille et al. 2012).
Die weiteren Untersuchungen sollen sich zunächst auf folgende drei Punkte konzentrieren:

  1. Messung der Interaktion zwischen dem ABC (SiiF) und dem C-terminalen Bereich von SiiE. Gibt es eine Korrelation zur Sekretionseffizienz?
  2. Detektion des Assemblierungsstatus des SiiCDF-T1SS
  3. Können (1.) und (2.) durch spezifische Umweltsignale beeinflusst werden und welche Proteine sind daran beteiligt?

Ein Gluc-SiiE Fusionsprotein wurde in einem Wildtyp-Stamm (A) und in einer T1SS Mutante (siiF, B) exprimiert. Die Wildtyp-Bakterien konnten das Konstrukt sekretieren und zeigten eine hohe Lumineszenz-Aktivität während für die T1SS-Mutante kaum Signal detektierbar war.

Modulation der Virulenzfunktionen durch Hypoxie

Kooperation mit Dr. Jonathan Jantsch, Erlangen

Es ist bekannt, dass in Geweben selten höhere Sauerstoffspannungen als 12% pO2 vorliegen und dass die physiologische Sauerstoffspannung zwischen 3 und 5% pO2 beträgt. Unter pathophysiologischen Bedingungen wie z.B. in soliden Tumoren oder Entzündungs- und Infektionsprozessen findet man regelmäßig Sauerstoffspannungen weit unter 2 % pO2. Man kann somit davon ausgehen, dass Salmonellen im Wirtsorganismus mit verringerten Sauerstoffkonzentrationen (Hypoxie) verschiedenen Ausmaßes konfrontiert sind. Hypoxie selbst könnte dabei ein Schlüsselsignal der Erkennung verschiedener Milieus im Wirtsorganismus durch Salmonellen darstellen.

Wir möchten in diesem Projekt im Detail die Rolle von Hypoxie bei der Wirts-Pathogen Interaktion von Salmonellen charakterisieren. Im Einzelnen interessiert uns der Einfluss von Hypoxie auf:

  • die antimikrobielle Kapazität von Makrophagen
  • die Funktion wichtiger Salmonella Virulenzfunktionen (SPI-1 und SPI-2).

Weiterhin möchten wir nach Wegen suchen, den in vivo für Salmonellen verfügbaren Sauerstoff zu messen.

Modulation von Virulenzfunktionen durch sublethale Konzentrationen antimikrobieller Peptide

Kooperation mit Prof. Dr. Markus Schnare, Marburg

Neben Hypoxie stellt unter anderem das Vorhandensein antimikrobielle Peptide und Proteine (AMPs) einen weiteren wirtsspezifischen Milieufaktor dar. AMPs greifen als Teil der angeborenen Immunität die Integrität der bakteriellen Zellwand an und führen zur Abtötung der Bakterien. Für diese bakteriozide Wirkung sind jedoch wahrscheinlich sehr hohe (lokale) Konzentrationen der AMPs notwendig. In vivo ist davon auszugehen, dass zumindest ein Teil der Population pathogener Bakterien sublethalen Konzentrationen der AMPs ausgesetzt ist, die nicht zur Abtötung führen.
Wir haben erste Hinweise darauf, dass Salmonellen auf die Gegenwart sublethaler Konzentrationen einiger AMPs mit der spezifischen Induktion von Adhäsion, der Anheftung an abiotische und biotische Oberflächen, reagieren. Dieses Phänomen soll weitergehend charakterisiert werden und zwar mit Fokus auf die beteiligten Adhäsions-Strukturen und die zugrundeliegende Signaltransduktion.

Stand: 10.02.2012

Ausgewählte Publikationen

  • Gerlach RG, Jäckel D, Stecher B, Wagner C, Lupas A, Hardt WD, Hensel M (2007): Salmonella Pathogenicity Island 4 Encodes A Giant Non-fimbrial Adhesin and The Cognate Type I Secretion System.
    Cellular Microbiology Jul;9 (7): 1834-50.

  • Gerlach RG, Jäckel D, Geymeier N, Hensel M (2007): Salmonella Pathogenicity Island 4-mediated Adhesion Is Co-regulated With Invasion Genes.
    Salmonella enterica. Infection and Immunit Oct;75 (10): 4697-709.

  • Gerlach RG, Claudio N, Rohde M, Jäckel D, Wagner C, Hensel M (2008): Cooperation of Salmonella pathogenicity islands 1 and 4 is required to breach epithelial barriers.
    Cell. Microbiol. 10 (11): 2364-2376. mehr

  • Masi M, Wandersman C (2010): Multiple Signals Direct the Assembly and Function of a Type 1 Secretion System.
    J. Bacteriol. 192 (15): 3861-3869. doi: 10.1128/​JB.00178-10. mehr

  • Wille T, Blank K, Schmidt C, Vogt V, Gerlach RG (2012): Gaussia princeps luciferase (Gluc) as reporter for transcriptional activity, protein secretion and protein-protein interactions in Salmonella enterica serovar Typhimurium.
    Appl. Environ. Microbiol. 78 (1): 250-257. Epub 2011 Oct 21. doi:10.1128/AEM.06670-11. mehr

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